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付朝杰副主任醫(yī)師 棗莊市婦幼保健院 新生兒科 一旦發(fā)生細菌性角膜炎，請及時就醫(yī)，規(guī)律、規(guī)范用藥，切不可自行在家治療。1.檢查：除了常規(guī)的裂隙燈，眼前段拍照，眼部b超，角膜共聚焦等檢查，醫(yī)生還會給與角膜病灶刮除物的培養(yǎng)、涂片、藥敏等檢查明確致病菌及有效的藥物。2.治療治療則根據(jù)病情選擇局部甚至全身抗細菌、抗炎的藥物，必要時還可能需要做治療性角膜移植、結(jié)膜瓣覆蓋等手術(shù)治療。常見局部抗生素滴眼液：左氧氟沙星滴眼液/眼膏、妥布霉素滴眼液/眼膏。妥布霉素滴眼液和眼膏的安全性是最高的，嬰幼兒也可以使用。但是對于中國主要角膜炎菌群，妥布霉素抗菌效果不如左氧氟沙星。其實，左氧氟沙星在臨床中必要時也會用于低齡兒，也很安全，只是臨床安全數(shù)據(jù)相對較少。所以，假如患有角膜炎，遵醫(yī)囑即可。而日常常用的，紅霉素眼膏、金霉素眼膏由于抗菌力低且目前大多菌都對其耐藥，對于已經(jīng)明確的感染通常治療效果微弱。2022年09月07日
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于剛主任醫(yī)師 北京兒童醫(yī)院 眼科 文章來源：中華檢驗醫(yī)學雜志,2022,45(1):14-23.摘要感染性眼病是發(fā)展中國家重要致盲原因之一，病原微生物檢查是感染性眼病診斷的金標準。由于眼部組織取材困難、標本量少，實驗室診斷陽性率偏低，嚴重影響疾病的診斷和預后。我國大多數(shù)醫(yī)療機構(gòu)感染性眼病實驗室診斷能力不足，缺乏眼部微生物檢測的標準化方法。為此，北京醫(yī)學會檢驗分會組織專家和相關(guān)課題組通過討論和臨床驗證，總結(jié)出適合我國眼科臨床實踐的病原學診斷路徑，形成感染性眼病實驗室診斷專家共識。該共識從常見感染性眼病臨床表現(xiàn)和送檢指征入手，規(guī)范眼部標本采集、轉(zhuǎn)運、質(zhì)量評估的方法和流程；強調(diào)眼科醫(yī)師應與微生物檢驗人員充分配合，正確選擇適宜的微生物檢測方法，提倡床旁接種，同時針對刮片細胞學檢查、傳統(tǒng)微生物培養(yǎng)、棘阿米巴培養(yǎng)以及核酸檢測、宏基因組測序等技術(shù)提出建議。感染性眼病是由病原微生物感染眼球組織及其附屬器（結(jié)膜、角膜、前房、玻璃體、瞼緣及淚器等），導致局部組織損傷、功能破壞，進而引起視力下降的一類致盲性疾?。?］。由于受衛(wèi)生條件及醫(yī)療水平的限制，這類疾病始終是中低收入國家的高發(fā)病。我國感染性角膜炎發(fā)病率為發(fā)達國家（約0.04%）的5倍，達到0.192%［1,?2,?3］；手術(shù)源性感染性眼內(nèi)炎也有上升趨勢，基層白內(nèi)障術(shù)后感染性眼內(nèi)炎發(fā)病率高達0.11%［4］，幾乎是發(fā)達國家的10倍（0.012%~0.053%）［5,?6,?7,?8］。然而，我國大多數(shù)醫(yī)療機構(gòu)感染性眼病微生物檢驗能力不足，缺乏有可靠病原學證據(jù)的臨床經(jīng)驗。2018年北京醫(yī)學會檢驗分會組織有關(guān)專家就此問題進行專項討論，借鑒國內(nèi)外先進的眼科病原學檢驗手段，建立適應于綜合醫(yī)院開展該項工作的標準化方法。在此基礎(chǔ)上，北京醫(yī)學會檢驗分會委托北京市眼科研究所及首都醫(yī)科大學附屬北京同仁醫(yī)院開展相關(guān)臨床驗證工作。經(jīng)過3年努力，分析整理1256例不同類型感染性眼病診療數(shù)據(jù)后，總結(jié)出適合我國眼科病原學診斷路徑、技術(shù)手段及應用場景，形成如下專家共識。一、常見病原體及送檢指征眼科臨床檢查及微生物實驗室檢查是感染性眼病診斷不可缺少的2個重要組成部分，因此在實驗室診斷過程中，檢驗醫(yī)師需清楚地了解樣本來源及患者臨床表現(xiàn)，以便對眼各個部位可能存在的病原體及不同類型眼部感染可能相關(guān)的微生物作出初步判斷。為此，本共識首先簡要介紹眼的解剖（圖1），使檢驗醫(yī)師在了解眼解剖基礎(chǔ)上，明確取材部位及標本來源；其次，詳細介紹常見感染性眼病送檢指征及具體檢查內(nèi)容（表1），建立病原學診斷路徑（圖2）。1.感染性結(jié)膜炎：結(jié)膜暴露于外界環(huán)境中容易發(fā)生感染性結(jié)膜炎，結(jié)膜充血及分泌物增多是其典型的臨床特征，多數(shù)結(jié)膜炎無需進行微生物檢查。但對于流行性、難治性、復發(fā)性或常規(guī)治療無效的感染性結(jié)膜炎，結(jié)膜刮片、培養(yǎng)或核酸檢測對其診療具有重要意義［9］。感染性結(jié)膜炎常見的病原體有金黃色葡萄球菌、肺炎鏈球菌、流感嗜血桿菌、其他α-溶血性鏈球菌、腸桿菌目、不動桿菌屬、棒狀桿菌屬、腺病毒（兒童3、7型；成人8、11、19型）、單純皰疹病毒（1、2型）、柯薩奇病毒A24型及腸病毒70型等。A~C血清型沙眼衣原體可引起沙眼性結(jié)膜炎，D~K血清型沙眼衣原體可引起包涵體性結(jié)膜炎［10,?11］。2.感染性角膜炎：感染性角膜炎多由病原微生物侵入角膜引起，對擬診化膿性角膜炎（細菌、真菌、阿米巴感染）者需通過實驗室檢查進行確診［12］。而對于非化膿性（病毒性）角膜炎者，可依靠反復發(fā)作的病史及角膜病變特點進行臨床診斷。由于角膜病灶取材量少，標本應立即進行涂片染色鏡檢或床旁微生物接種；除常規(guī)角膜刮片和培養(yǎng)外，還可選擇進行病原體核酸檢測。細菌性角膜炎以金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、肺炎鏈球菌、溶血性鏈球菌、銅綠假單胞菌（隱形眼鏡）及腸桿菌目細菌等感染為主［13］；非典型分枝桿菌（龜分枝桿菌、偶發(fā)分枝桿菌、膿腫分枝桿菌）較為少見，一般見于創(chuàng)傷后或屈光手術(shù)后的患者。病毒性角膜炎以單純皰疹病毒（1、2型）、水痘-帶狀皰疹病毒、柯薩奇病毒A24、腸道病毒70感染為主，另外埃博拉病毒和蟲媒病毒感染（寨卡病毒、登革熱和基孔肯雅病毒）可引起輕度角膜炎［14］。真菌性角膜炎常發(fā)生于植物外傷或有眼表慢性疾病的患者中，常見的絲狀真菌有鐮刀菌、曲霉菌、絲孢菌屬、擬青霉屬、支頂孢屬和彎孢菌屬等。在免疫功能低下的患者中，可出現(xiàn)念珠菌、隱球菌引起的角膜炎［15］。寄生蟲性角膜炎罕見，以棘阿米巴原蟲感染為主，另外還有微孢子蟲、變形蟲及蠅蛆幼蟲所致的角結(jié)膜炎［16］。3.感染性瞼緣炎：瞼緣出現(xiàn)如下體征之一可疑診為感染性瞼緣炎。（1）瞼緣充血、睫毛脫落，睫毛基底部見小膿皰、鱗屑或袖套樣物質(zhì)；（2）對于經(jīng)驗性治療無效的前部瞼緣炎患者可進行瞼緣分泌物培養(yǎng)［17］（需氧及厭氧培養(yǎng)同時進行）；（3）對于瞼板腺功能障礙或眼部紅斑痤瘡患者，睫毛有袖套樣改變時，需進行睫毛螨蟲顯微鏡檢查，涂片和培養(yǎng)有助于發(fā)現(xiàn)病原菌。常見病原體有金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、痤瘡皮膚桿菌、酵母菌（皮屑芽孢菌）、毛囊蠕形螨（睫毛根部）、蠅蛆幼蟲及陰虱等，注意區(qū)別正常菌群［18］。4.感染性淚道炎：淚液的排出系統(tǒng)稱為淚道，出現(xiàn)如下體征可擬診為淚道感染，如淚溢、內(nèi)眥部黏性分泌物，淚小點或淚囊處紅腫，擠壓淚小點或淚囊后可見膿性分泌物溢出。經(jīng)驗性治療無效的淚小管炎或淚囊炎并發(fā)角結(jié)膜炎或眶蜂窩織炎患者，需進行淚道分泌物細胞微生物學檢查［19］。常見病原體有放線菌科屬（放線菌屬和諾卡菌屬最常見）、肺炎鏈球菌、溶血性鏈球菌、流感嗜血桿菌、金黃色葡萄球菌及革蘭陰性桿菌等。淚道真菌（曲霉菌、鏈格孢霉、念珠菌、枝頂孢屬）感染較罕見［20］。5.感染性眼內(nèi)炎：特指微生物在眼內(nèi)引起的感染，進展迅速，屬臨床急重癥致盲性眼病，包括眼內(nèi)炎（細菌、真菌）、病毒性眼內(nèi)炎、寄生蟲性眼內(nèi)炎等。感染性眼內(nèi)炎常合并開放性眼外傷、內(nèi)眼手術(shù)史、糖尿病、器官移植、長期免疫抑制劑使用史。表現(xiàn)為眼紅、眼痛、流淚、視力下降，睫狀充血、房水閃輝、房水浮游細胞乃至前房積膿、瞳孔后粘連、玻璃體明顯混濁、視網(wǎng)膜前絨球樣混濁等［21］。外源性眼內(nèi)炎常見于術(shù)后感染和眼外傷（特別是白內(nèi)障和青光眼術(shù)后），常見病原體包括葡萄球菌、腸球菌、鏈球菌、腸桿菌、非發(fā)酵菌、需氧芽孢桿菌、曲霉菌、鐮刀菌、暗色真菌等，表現(xiàn)為多病原體混合感染，其中凝固酶陰性葡萄球菌易造成急性感染，痤瘡皮膚桿菌是慢性感染最常見原因，警惕高毒力肺炎克雷伯菌的眼內(nèi)感染，假單胞菌與絲狀真菌少見［22］。內(nèi)源性眼內(nèi)炎多來自血源性感染，常見病原體有肺炎鏈球菌、葡萄球菌、α-溶血性鏈球菌、分枝桿菌、酵母菌、絲狀真菌、腸球菌、乏養(yǎng)球菌、顆粒鏈菌、流感嗜血桿菌、韋榮球菌、普雷沃菌、念珠菌等。視網(wǎng)膜炎以病毒感染為主，包括單純皰疹病毒、巨細胞病毒、帶狀皰疹病毒、EB病毒等［23］。虹膜、睫狀體和/或脈絡膜的炎癥可與細菌來源（伯氏疏螺旋體、梅毒螺旋體、分枝桿菌、鉤端螺旋體、巴爾通體）、病毒來源（皰疹病毒、巨細胞病毒）或寄生蟲來源（弓蛔蟲、弓形蟲、盤尾絲蟲、囊尾蚴）的全身性或局部性感染有關(guān)。剛地弓形蟲是脈絡膜視網(wǎng)膜炎的元兇，是感染性后葡萄膜炎的主要原因［24］。二、標本采集及質(zhì)量評估（一）標本采集及轉(zhuǎn)運原則參考2018年美國微生物實驗室操作指南、2021年美國眼部感染臨床微生物實驗室實用指南以及2021年歐洲微生物手冊制定如下規(guī)則［25,?26］。1.強調(diào)“即刻送檢、即刻涂片、床旁接種”原則，尤其需進行厭氧培養(yǎng)的標本；若難以實現(xiàn)即刻接種，則需室溫保存，標注采集時間。標本采集、儲存、轉(zhuǎn)運方法見表2。2.用于培養(yǎng)的標本原則上需同時進行細胞微生物學檢查；用于PCR的標本，需避免滑石粉、熒光素鈉和眼部麻醉劑的使用。3.由于眼部標本較為珍貴且標本量少，醫(yī)生應告知實驗室具體檢測項目及優(yōu)先次序。4.結(jié)膜分泌物應雙眼取材并在申請單注明眼別、部位，以便于結(jié)膜囊正常菌群的分析。5.角膜潰瘍標本應由具有臨床經(jīng)驗的眼科醫(yī)師或眼科技師在裂隙燈顯微鏡下使用無菌刮鏟或無菌手術(shù)刀片輕柔刮取，即刻涂片并床旁接種。角膜組織和活檢標本建議使用無菌剪刀或手術(shù)刀片切碎后再行接種；眼內(nèi)標本（房水或玻璃體）需手術(shù)取材，使用原液進行涂片、接種。6.眼內(nèi)液包括房水和玻璃體液，有創(chuàng)性眼內(nèi)液檢測，僅適用于高度懷疑的感染性眼內(nèi)炎患者，須由有經(jīng)驗眼科醫(yī)師在無菌環(huán)境下采集。操作前需用抗生素（如氧氟沙星、妥布霉素）滴眼液點眼，表面麻醉后皮膚消毒、聚維酮碘結(jié)膜囊沖洗。房水取出量以0.05~0.1ml為宜，玻璃體灌洗液則需離心（800轉(zhuǎn)/min×10min，離心半徑10cm）后取沉淀涂片或甩片后顯微鏡檢查或微生物培養(yǎng)，也可使用0.22μm無菌過濾器過濾，將過濾膜進行細菌和真菌培養(yǎng)。房水或玻璃體標本，可注入無菌EP管中進行轉(zhuǎn)運，也可將注射器連帶針頭及針帽，置于密閉標本轉(zhuǎn)運箱中快速轉(zhuǎn)運。7.隱形眼鏡或與眼外傷相關(guān)異物也可進行微生物檢測，但其培養(yǎng)結(jié)果需根據(jù)病情謹慎解釋。（二）標本質(zhì)量評估眼部標本不建議拒收，即使標本量少、轉(zhuǎn)運超時，仍要盡可能完成檢驗，及時與臨床醫(yī)生溝通，爭取二次送檢。標本評估應遵循如下原則。1.刮片標本評估：進行刮片細胞微生物學檢查的標本，如分泌物、膿液或壞死組織應制成均勻薄層涂片，直徑約10mm。除玻璃體灌洗液需離心后取沉淀或甩片外，其余均應使用原始標本。（1）組織標本評估：載玻片上肉眼可見分泌物、膿液或壞死組織薄層平鋪，不形成組織細胞堆積。（2）角膜刮片評估：角結(jié)膜病灶及周圍脫落或炎性細胞數(shù)量須≥1級。國際上將刮片細胞數(shù)量（顯微鏡下可見到的所有細胞）分為4級，即以低倍鏡（LP）下細胞計數(shù)為準，0級：≤10/LP，1級：11~50/LP，2級：51~100/LP，3級：101~1000/LP，4級：>1000/LP［27］。其他組織標本（如房水和玻璃體等）也可參照此標準。2.培養(yǎng)標本評估：包括標本采集前是否使用抗菌藥物、抗菌藥物種類及時間；采集方式、轉(zhuǎn)運裝置、采樣量；是否床旁接種、是否在2h內(nèi)送達實驗室；申請檢查項目的適宜性等。由于不建議拒收標本，因此對評估不合格的標本需在結(jié)果報告中進行描述。三、實驗室檢查（一）刮片細胞微生物學檢查對于感染性眼病實驗室診斷，除睫毛螨蟲、陰虱或結(jié)膜吸吮線蟲外，在培養(yǎng)、核酸及免疫學檢測之前均應進行細胞微生物學檢查，強調(diào)從病理學角度重視眼部刮片細胞學檢查。刮片染色方法選擇取決于臨床擬診及疑似的病原體類型。常用的染色方法包括姬姆薩染色、革蘭染色、熒光染色和抗酸染色等。常用染色方法及檢查對象見表3。1.姬姆薩染色：用于組織病理及病原體形態(tài)學檢查，是眼科最常用的染色方法。根據(jù)病原體形態(tài)特征及排列方式可對細菌、包涵體、真菌、阿米巴等微生物進行鑒別，眼部常見病原微生物姬姆薩染色后顯微鏡下特征見表4。姬姆薩染色也可對病灶處的角結(jié)膜上皮細胞、炎性滲出細胞（中性粒細胞、淋巴細胞、嗜酸性粒細胞、單核吞噬細胞、漿細胞及肥大細胞等）以及特殊組織細胞進行觀察。按照炎性細胞所占比例可判斷感染還是非感染，急性感染（中性粒細胞為主）還是慢性感染（淋巴細胞增多）；同時，不同微生物感染周圍炎癥細胞類型有所差異，如棘阿米巴感染可出現(xiàn)嗜酸性粒細胞浸潤；衣原體感染急性期以中性粒細胞浸潤為主，病毒感染則以淋巴細胞浸潤為主，可出現(xiàn)細胞內(nèi)包涵體。2.革蘭染色：鏡下描述同常規(guī)微生物檢查。根據(jù)菌體形態(tài)（桿菌、球菌、球桿菌）、染色特性（陽性、陰性或不確定）、排列方式（成雙、成堆或散在，短鏈或長鏈等）、白細胞吞噬等因素判斷。如涂片見到大量中性粒細胞，細胞內(nèi)外可見革蘭陽性雙球菌、呈矛頭樣相對排列、有厚莢膜，可報告疑似肺炎鏈球菌［28］。3.熒光染色：利用熒光素標記的幾丁質(zhì)酶可特異性結(jié)合真菌細胞壁的多糖及幾丁質(zhì)，5min內(nèi)快速判斷標本中是否含有真菌成分。組織背景為均質(zhì)黑色或弱藍色熒光，真菌細胞壁則呈亮藍紫色或明亮熒光藍，容易識別菌絲或孢子形態(tài)、結(jié)構(gòu)、菌絲密度等［29］。因棘阿米巴包囊同樣含幾丁質(zhì)成分，包囊也可呈淡染的藍綠色。熒光染色可顯著提高對真菌、微孢子蟲和棘阿米巴診斷的敏感性，但需注意拭子棉纖維以及任何含纖維素或幾丁質(zhì)的其他物質(zhì)可能會造成假陽性。4.抗酸染色及弱抗酸染色：抗酸染色可對眼部抗酸菌，主要包括結(jié)核分枝桿菌（M.tuberculosis，MTB）、非結(jié)核分枝桿菌（nontuberculoausmycobacteria，NTM）進行檢測。疑似諾卡菌感染或微孢子蟲可使用弱抗酸染色，菌體或蟲體呈粉紅色著染為陽性。5.濕片法：常用的方法有生理鹽水濕片法和KOH濕片法，其中生理鹽水濕片法主要用于棘阿米巴滋養(yǎng)體和包囊的活體觀察，尤其適用于觀察滋養(yǎng)體的運動情況。棘阿米巴滋養(yǎng)體在角膜組織間移行，呈不規(guī)則、易變化等特點，其胞質(zhì)內(nèi)富含顆粒物質(zhì)，可隨滋養(yǎng)體的變形而運動。囊前期包囊雙層囊壁尚未形成，胞質(zhì)內(nèi)含有均勻的較粗大顆粒狀物，較活躍，不停顫動。成熟包囊具有內(nèi)外囊壁雙層結(jié)構(gòu)。空囊則呈皺縮狀、無內(nèi)容物，常見于抗阿米巴治療后。KOH濕片法也可用于絲狀真菌的觀察，將采集的標本混勻涂于滴有10%~20%KOH溶液的清潔載玻片上，加蓋玻片，過酒精燈火焰2~3次，冷卻后低倍鏡觀察。KOH可消化組織細胞，使真菌菌絲清晰可見。6.寄生蟲檢查：除棘阿米巴原蟲外，常見眼部寄生蟲還包括結(jié)膜吸吮線蟲、睫毛的螨蟲及陰虱。結(jié)膜吸吮線蟲生長于結(jié)膜囊內(nèi)，裂隙燈下可見白色線頭樣蟲體蠕動，鑷子取出光學顯微鏡下進行觀察。螨蟲位于睫毛毛囊內(nèi)，光學顯微鏡下（100倍）尋找蠕形螨成蟲、幼蟲或蟲卵。陰虱常生長于睫毛毛根及毛干，裂隙燈下剪除或拔取睫毛后光學顯微鏡下觀察成蟲及蟲卵，容易診斷。（二）傳統(tǒng)微生物培養(yǎng)1.培養(yǎng)基：眼部微生物常規(guī)培養(yǎng)包括需氧、兼性厭氧、厭氧及真菌培養(yǎng)等，必要時可增加微需氧及分枝桿菌培養(yǎng)。常用培養(yǎng)基包括哥倫比亞血瓊脂、巧克力瓊脂，必要時增加麥康凱、沙保羅、馬鈴薯及厭氧血瓊脂培養(yǎng)基。強調(diào)厭氧培養(yǎng)的重要性，同時眼微生物醫(yī)/技師需與臨床醫(yī)師密切溝通，對來之不易的標本盡可能全面進行有助于診斷的檢驗項目。2.培養(yǎng)條件：生化培養(yǎng)箱適用于不同溫度下生長的細菌及真菌的培養(yǎng)，一般情況下，細菌培養(yǎng)溫度34~36℃，2~5d；真菌培養(yǎng)溫度27~29℃或34~36℃，7~30d。細菌培養(yǎng)的環(huán)境包括需氧、厭氧（厭氧袋、厭氧罐及厭氧手套箱），5%~7%CO2培養(yǎng)箱，微需氧等；除常規(guī)哥倫比亞血瓊脂培養(yǎng)3~5d外，分枝桿菌的生長需要羅氏或米氏7H10培養(yǎng)基以及BACTECMGIT培養(yǎng)系統(tǒng)，7d后觀察生長情況，培養(yǎng)最長需56d。眼部真菌適合馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基或沙氏培養(yǎng)基斜面，每日觀察，刮片/涂片呈陽性但培養(yǎng)為陰性、懷疑罕見或生長緩慢真菌應延長觀察期至4~8周。3.關(guān)于增菌：眼部感染標本不建議增菌，尤其來自與外界相通部位分泌物，如結(jié)膜、淚道、淚囊。術(shù)中取材的房水、玻璃體液及角膜等可進行增菌。4.微生物鑒定：基于菌落的生化試驗、自動化儀器及MALDI-TOF質(zhì)譜是目前常用的鑒定手段，后者無論針對細菌還是真菌均可實現(xiàn)快速鑒定。必要時可選用rDNA（16S、18S或28S）及ITS/D1D2測序技術(shù)進行鑒定。5.抗菌藥物敏感實驗：國內(nèi)基本選擇臨床實驗室標準化協(xié)會（clinicalandlaboratorystandardsinstitute，CLSI）標準［30］，但眼科多局部用藥，其局部暴露劑量遠高于血清藥物濃度，抗菌藥物敏感實驗（antimicrobialsusceptibilitytesting，AST）結(jié)果僅供參考。對外眼標本，有時無法鑒別分離菌株為共生菌群、污染或感染真正病原體，除凝固酶陰性的葡萄球菌（非路鄧葡萄球菌）和類白喉棒狀桿菌外，對單一微生物純培養(yǎng)或培養(yǎng)出2種優(yōu)勢病原體，需行鑒定和AST（金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌無論菌落多少，均應行鑒定和AST）。相較之下，內(nèi)眼標本應作為無菌部位處理，任何培養(yǎng)陽性病原體皆需鑒定和AST。如果CLSI缺少某種抗菌藥物的判定標準，可參考本地流行病學結(jié)果用藥。（三）棘阿米巴培養(yǎng)及鑒定棘阿米巴性角膜炎多由棘阿米巴原蟲感染所致，偶有耐格里屬感染的報道。角膜棘阿米巴原蟲的培養(yǎng)常規(guī)選擇Page非營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，其固體培養(yǎng)基可在100ml液體培養(yǎng)基中加入1.5g瓊脂。在使用Page非營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基前，應在其瓊脂表面涂布活的或滅活的大腸埃希菌菌液，標本點種于瓊脂中心，置于濕盒內(nèi)28℃孵育，每天觀察，至少觀察至第10d。棘阿米巴可自瓊脂表面接種部位生長并向四周移行，產(chǎn)生不規(guī)則軌跡，培養(yǎng)1d即可在顯微鏡下觀察到，接種5~10d后可通過肉眼觀察發(fā)現(xiàn)瓊脂表面出現(xiàn)菲薄波紋狀改變，低倍鏡下見到小圓形或多邊形壁厚包囊，折光性強；滋養(yǎng)體呈圓形、橢圓形、不規(guī)則等形態(tài)，并向四周移行覓食，所以接種部位的遠端則以滋養(yǎng)體居多。用小刀片切取一片表面瓊脂，在顯微鏡的油鏡下觀察，可清晰分辨出棘阿米巴滋養(yǎng)體和包囊的形態(tài)、結(jié)構(gòu)。因抗阿米巴藥物有限，臨床上無需常規(guī)開展抗棘阿米巴藥物敏感試驗，在新藥研發(fā)時可采用微量稀釋法。（四）核酸檢測目前尚無國家藥品監(jiān)督管理局批準的眼部標本核酸擴增檢測試劑，大部分核酸檢測采用實驗室自行建立的方法，對常規(guī)培養(yǎng)陰性的標本，核酸檢測成為診斷病毒性角膜炎、葡萄膜炎和視網(wǎng)膜炎的主要手段。利用實時定量PCR（quantitativereal-timePCR，qPCR）技術(shù)檢測腺病毒、巨細胞病毒、單純皰疹病毒、水痘帶狀皰疹病毒、EB病毒和弓形蟲等病原微生物已在業(yè)界達成共識［31,?32］。該方法特異度和敏感度較高［33］，可通過拷貝數(shù)評估感染現(xiàn)狀和治療效果，其陽性預測值和陰性預測值優(yōu)于傳統(tǒng)微生物檢測方法［34］。qPCR技術(shù)適用于急性感染期，恢復期或一過性感染，可出現(xiàn)假陰性結(jié)果［35］。此外，可利用16SrDNA和18SrDNA測序技術(shù)提高檢出率。2017年，熒光原位雜交技術(shù)（flourescenceinsituhybridization，F(xiàn)ISH）首次用于眼科，利用葡萄球菌特異性分子肽核酸（peptidenucleicacid，PNA）探針進行肽核酸熒光原位雜交（PNA-FISH），20min即可實現(xiàn)眼內(nèi)液病原體檢測［36］。近期，有研究擴大了FISH與PNA探針的應用范圍，可快速檢測眼內(nèi)炎或角膜炎的常見細菌和真菌病原體（敏感度97%、特異度100%）［37］。對核酸檢測標本，無菌取材后，應立即放置于封閉的滅菌容器中（如耐低溫的凍存離心管）。對于需檢測RNA的標本，應放置于冰盒內(nèi)送至實驗室，48h內(nèi)完成RNA的提??；需檢測DNA的標本，可常溫保存，但不能超過72h，否則需-20℃或-80℃低溫保存；另外避免標本反復凍融對蛋白樣品的破壞。對于眼部無菌標本，常規(guī)檢驗無法滿足實驗室診斷時，可選擇宏基因組下一代測序技術(shù)（metagenomicsnextgenerationsequencing，mNGS）。該技術(shù)的無偏倚性使其成為未知病原體識別的重要手段［38］。有研究表明mNGS診斷眼內(nèi)炎的敏感度為88%，在鑒定未知低豐度微生物時，mNGS靈敏度優(yōu)于其他方法［39］。但mNGS受標本量、標本處理、核酸提取、文庫制備及測序深度的影響，結(jié)果的準確性和特異度有待臨床進一步驗證。非無菌部位眼科標本可檢測出多種微生物，臨床上難以判斷其是否致病。盡管mNGS存在局限性，但目前仍是眼科難培養(yǎng)病原體的檢測手段之一。（五）免疫學檢測繼發(fā)于全身感染的視網(wǎng)膜炎或葡萄膜炎患者可進行血清學檢查，如梅毒螺旋體、剛地弓形蟲和伯氏疏螺旋體等的診斷。血清、房水、玻璃體液及淚囊分泌物均可進行病原體（包括皰疹病毒、巨細胞病毒、弓形蟲、梅毒）特異性抗體和總IgG檢測，方法包括酶聯(lián)免疫吸附試驗（enzyme-linkedimmunosorbentassay，ELISA）、免疫熒光法（immunofluorescenceassay，IFA）及免疫印跡法（immunoblottingtest，IBT）等。標本采集時機對結(jié)果解釋非常重要，當IgG抗體恢復期較初期增高4倍或顯著增高，且急性期顯著增高可判斷為陽性。有文獻報道初次感染弓形蟲后，IgM和IgA在感染后7~14d達高峰，IgG在感染14~21d開始上升并持續(xù)較長時間。IgM陽性對早期感染的診斷具有一定意義，IgG恢復期4倍高于急性期有回顧性診斷意義。通過計算Goldmann-Witmer（GW）系數(shù)，可輔助判斷眼內(nèi)該特異抗體是眼內(nèi)原位產(chǎn)生，還是因為血清滲漏出現(xiàn)的假陽性。系數(shù)≥4表示局部抗體的產(chǎn)生，系數(shù)<2表示局部抗體的缺失，2~3取決于臨床情況［27］。另外，抗體的檢測與患者的免疫狀態(tài)有關(guān)，免疫功能正常者若血清學檢測結(jié)果陰性可排除感染；而免疫功能低下者，其抗體合成能力有限，出現(xiàn)假陰性需謹慎解釋免疫學結(jié)果。抗體的產(chǎn)生還與自身抗體、補體及免疫抑制劑使用有關(guān)，因此結(jié)果解釋必須結(jié)合臨床。多項研究證實，聯(lián)合應用GW系數(shù)、免疫印跡法和PCR，診斷的特異度高于99%。四、報告要求眼科微生物檢測報告包括標本信息、標本處理方法、質(zhì)量評估及微生物檢驗（顯微鏡檢查、微生物培養(yǎng)、鑒定和藥敏實驗）結(jié)果?；谥腥A醫(yī)學會檢驗醫(yī)學分會2017年制定的細菌與真菌涂片鏡檢和培養(yǎng)結(jié)果報告規(guī)范專家共識（簡稱2017細菌真菌報告共識）［40］，結(jié)合本共識提出如下眼科微生物檢驗報告要求。（一）標本信息及處理方法常見感染性眼病標本類型包括結(jié)膜囊分泌物、角膜病灶刮取物、瞼緣或淚道分泌物、前房房水、玻璃體等，送檢標本時須準確標注取材部位及取材方式，如術(shù)中取材、床旁接種、拭子轉(zhuǎn)運、送檢時間等，同時需注明標本處理方法，如離心沉淀、甩片、研磨等，以及涂片染色和培養(yǎng)方法。（二）標本質(zhì)量評估結(jié)果按照前述方法進行。注明標本是否合格，不合格標本須注明原因。目前國際上沒有房水和玻璃體標本的質(zhì)量標準，可按照角結(jié)膜標本的標準執(zhí)行。由于取材不易，即使標本量少也不推薦拒收，可在報告單上注明其對結(jié)果可能產(chǎn)生的影響。（三）顯微鏡檢查報告1.微生物學報告：若涂片未發(fā)現(xiàn)微生物，則報告：某種染色未見細菌、真菌及寄生蟲；如果陽性，則報告：某種染色可見細菌或真菌或寄生蟲，描述菌體特征、數(shù)量及周圍細胞學變化，并進行初步診斷。（1）細菌特征描述應包括染色后菌體形態(tài)（桿菌、球菌、球桿菌）、染色特征（陽性、陰性或不確定）、排列方式（雙球菌、葡萄狀、四聯(lián)等）。菌體數(shù)量建議使用2017細菌真菌報告共識中半定量的報告方式，即油鏡（×1000）觀察，每視野≤1個細菌，記為+；1~5個細菌，記為++；6~30個細菌，記為+++；>30個細菌，記為++++［40］。給出初步疑似病原菌。（2）真菌應分別敘述孢子和菌絲的形態(tài)、位置、大小、排列以及著色性等，菌絲要區(qū)別真假菌絲。對形態(tài)特征典型的菌絲和孢子，可報告疑似微生物；如發(fā)現(xiàn)酵母樣孢子和假菌絲，可報告查到酵母樣真菌孢子及假菌絲；姬姆薩染色發(fā)現(xiàn)長絲狀菌絲、有隔，分枝呈45°，可報告查到真菌菌絲，有隔、45°分枝，疑似曲霉菌等。（3）通過姬姆薩染色或生理鹽水濕片可觀察棘阿米巴原蟲的滋養(yǎng)體、包囊前期、包囊及空囊4個階段，在報告中應詳細描述原蟲的形態(tài)特征，參考細胞計數(shù)方法描述原蟲的數(shù)量。對螨蟲，可報告多少只（數(shù)量）成蟲、幼蟲、蟲卵/高倍視野。其他寄生蟲可進行蟲體描述，給出初步診斷。2.細胞分類：除描述微生物特征外，還應報告細胞分類，如角結(jié)膜上皮細胞、色素上皮細胞、炎性滲出細胞（中性粒細胞、嗜酸性粒細胞、單核吞噬細胞、淋巴細胞及漿細胞等）及特殊的組織細胞等。同時還應報告炎性細胞與病原體之間的關(guān)系。建議圖文報告，給出初步擬診。3.細胞計數(shù)：每油鏡視野下，≤1個細胞，記為+；每1~5個細胞，記為++；6~30個細胞，記為+++；>30個細胞，記為++++［40］。4.顯微鏡檢查結(jié)果報告：建議進行快速報告模式，一般報告建議在2h內(nèi)發(fā)出，復雜報告不應超過4h發(fā)出。對重要病原（如疑似蠟樣芽孢桿菌或鐮刀菌等），報告建議走危急值。（四）培養(yǎng)及藥敏報告1.培養(yǎng)陽性的報告：對培養(yǎng)陽性的標本，需參照標本來源進一步確定是否為致病微生物。結(jié)膜、瞼緣等部位有正常菌群定植，免疫力低下時定植菌也可導致感染；角膜、房水及玻璃體等部位通常無菌，分離到的任何微生物應考慮病原體感染的可能［41］。此外，看到革蘭陽性粗大桿菌應及時（2h內(nèi)）給出報告，提示臨床（用藥應覆蓋蠟樣芽孢桿菌）。最后培養(yǎng)結(jié)果需結(jié)合標本質(zhì)量、鏡檢和臨床擬診進行綜合判斷。2.培養(yǎng)陰性的報告：對于培養(yǎng)陰性的標本，無論是有菌部位還是無菌部位均應報告“經(jīng)多少天某種方法培養(yǎng)，無菌生長”。如果報告發(fā)出后培養(yǎng)仍在繼續(xù)，則在報告單上寫明“培養(yǎng)將繼續(xù)進行多少天，此報告為初級報告，最終結(jié)果多少天后查詢”。3.疑似污染的報告：對疑似污染的分離株，應認真查找污染來源，如果最后確定為實驗室內(nèi)污染菌，結(jié)果不應回報臨床；如果該菌為實驗室外污染菌，又難以確定污染來源，則需與臨床醫(yī)生進行溝通，如實填寫“經(jīng)多少天某種培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)某種菌生長，因無法區(qū)分污染和感染，建議二次送檢”。4.混合感染的報告：對于混合感染（即分離到2種及以上微生物），可能涉及細菌、真菌及寄生蟲（如阿米巴）多重感染，尤其淚器感染常有多種細菌共存?；旌细腥緢蟾娴某鼍邞鶕?jù)標本特征、結(jié)合臨床綜合判斷。5.藥敏報告：眼部細菌藥敏報告需注明各類抗菌藥物對待測菌種的藥敏判定標準（即折點），如缺乏折點或借用其他菌種、文獻的折點，應備注說明。同時在報告中還應給出本實驗室所用標準的版本號和出版時間。眼部細菌藥敏實驗包括MIC法和紙片擴散法，因此藥敏報告應給出MIC的數(shù)值或抑菌圈直徑，同時根據(jù)折點進行結(jié)果解釋。（五）其他免疫學檢查多為定性試驗，需注明方法學類型。特異性核酸擴增有qPCR和定性PCR，按說明書要求報告。mNGS對常規(guī)檢查陰性的病原微生物有診斷價值，條件致病菌應在微生物專家指導下解讀。五、小結(jié)眼科醫(yī)生在申請檢查項目前應全面評估眼部病變情況，根據(jù)臨床擬診選擇染色及培養(yǎng)方法。如果出現(xiàn)刮/涂片結(jié)果與培養(yǎng)不一致時，實驗室人員應及時與臨床醫(yī)生溝通。如果膿性標本培養(yǎng)陰性應考慮多種因素影響，如取材、轉(zhuǎn)運方式、轉(zhuǎn)運周期、抗生素使用、麻醉劑的影響、特殊病原體等。在此，強調(diào)眼科醫(yī)師應與微生物檢驗人員充分配合，正確采集標本，提倡床旁接種。實驗室應建立滿足眼科病原體檢驗技術(shù)平臺，除傳統(tǒng)培養(yǎng)外應具備核酸、抗體和特殊染色的檢測方法，補充病毒、非典型病原體及寄生蟲等檢查內(nèi)容。常用抗菌藥物敏感試驗折點并不適合眼科局部用藥，多數(shù)情況仍需依靠醫(yī)生經(jīng)驗或結(jié)合當?shù)亓餍胁W數(shù)據(jù)。2022年08月15日1243
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齊穎主任醫(yī)師 北京同仁醫(yī)院 屈光科 各種因素導致的角膜炎癥反應統(tǒng)稱為角膜炎。表現(xiàn)為眼紅、眼痛、畏光、流淚、異物感、視物不清、黑眼珠變白等。角膜炎透明的角膜變?yōu)榛鞚?，可以是局部小面積的，也可以是全角膜，表現(xiàn)為不同程度的視力下降，是常見的致盲眼病之一。 治療角膜炎的基本原則是采取一切有效措施迅速控制感染，爭取早日治愈，將角膜炎的后遺癥減少到最低程度。 由于大多數(shù)潰瘍性角膜炎為外因所致，因此，除去致病外因，消滅致病微生物極為重要。與全身疾病有關(guān)的角膜病變除眼部治療外，還應積極治療原發(fā)病。 治療過程中注意觀察，若結(jié)膜充血減輕，角膜病變縮小變平，說明治療有效。若結(jié)膜充血加重，角膜病變向深及周圍擴展，前房積膿明顯，表面病情惡化，治療無效，應及時調(diào)整治療方案。保守治療無效或潰瘍遺留瘢痕明顯影響視力行角膜移植手術(shù)。 當眼睛出現(xiàn)不適應當立即去醫(yī)院檢查,檢查全身和局部致病因素?；撔匝装Y應做涂片檢查，細菌、真菌培養(yǎng)及藥敏試驗。樹支狀及淺層點狀角膜炎做免疫學檢查等。2019年10月17日1897
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