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地中海貧血的胚胎植入前遺傳學(xué)診斷
α-地中海貧血 (簡稱 α-地貧 )是由于 α-珠蛋白基因的缺失或功能障礙導(dǎo)致α-珠蛋白肽鏈缺如或合成不足所引起的遺傳性血液病 ,它是我國南方最常見且危害最嚴重的遺傳病種之一。重癥 α-地貧為致死性疾病。據(jù)統(tǒng)計我國南方人群中α-地中海貧血基因攜帶率約為10%［1］。β地中海貧血（簡稱β地貧）的發(fā)生主要是由于基因的點突變，少數(shù)為基因缺失?；蛉笔Ш陀行c突變可致β鏈的生成完全或者部分受抑制導(dǎo)致β-珠蛋白肽鏈缺如或合成不足引起的遺傳性血液病。重型的β地中海貧血臨床上表現(xiàn)為慢性溶血性貧血，需要進行昂貴的反復(fù)輸血及鐵螯合劑去鐵治療。我國南方人群中β地中海貧血(簡稱β地貧)致病基因攜帶率為2.8%［2］ 。本病我國長江以南各省均有報道，以廣東、廣西、海南、四川、重慶等省區(qū)發(fā)病率較高。由于地中海貧血對家庭及子代的嚴重的危害，對攜帶有地中海貧血基因的夫婦進行子代的地中海貧血基因診斷非常重要。過去,產(chǎn)前診斷是對攜帶地中海貧血基因的夫婦診斷子代是否患病的唯一方法。產(chǎn)前診斷包括在早孕晚期進行絨毛組織活檢或者在中孕期進行羊膜穿刺術(shù)獲得胎兒的細胞進行DNA分析。在產(chǎn)前診斷過程中，這些夫婦要面臨諸如：妊娠丟失的風(fēng)險、等待診斷的時間、以及終止妊娠的艱難抉擇等問題帶來的巨大的壓力和不安。更不幸的是，每一次的妊娠，他們都必須要面對這種兩難的境地。產(chǎn)前診斷技術(shù)在明確診斷的同時也給患者帶來了巨大的心理和生理上影響。胚胎植入前遺傳學(xué)診斷（preimplantation genetic diagnosis， PGD）技術(shù)應(yīng)用于人類單基因疾病診斷首先報道于1989年［3］。PGD技術(shù)因其可以在妊娠前對胚胎進行遺傳學(xué)診斷并選擇后移植，避免了進行產(chǎn)前診斷所面臨的風(fēng)險，目前被越來越多的患者接受并應(yīng)用于子代的地中海貧血的診斷當(dāng)中。一、PGD的取材PGD 活檢材料的來源目前主要有卵母細胞的活檢、卵裂胚胎的卵裂球和囊胚的滋養(yǎng)外胚層細胞活檢。（一）極體活檢極體是卵母細胞成熟分裂的產(chǎn)物，既不參與胚胎的發(fā)育，又無任何已知的功能。故可取第一極體作為活檢材料，遺傳學(xué)診斷后，按分離律原理診斷卵母細胞的遺傳學(xué)組成。不過減數(shù)分裂時同源染色體會發(fā)生交換，因此Verlinsky 等提出用兩步分析法，即在獲卵當(dāng)天取第一極體后，IVF 次日再取第二極體進行分析［4］。此方法已成功用于囊性纖維化、β -地中海貧血等疾病的PGD。（二）卵裂球活檢卵裂期胚胎的卵裂球是全能的，實驗證明8細胞期胚胎活檢1～2個卵裂球不影響胚胎的發(fā)育?，F(xiàn)絕大多數(shù)OGD中心，都采用該法進行活檢。（三）囊胚活檢卵裂胚胎經(jīng)序貫培養(yǎng)成囊胚后，行滋養(yǎng)外胚層活檢可獲6個或更多個細胞，可克服極體和卵裂球單細胞遺傳學(xué)分析的缺點，增高診斷的成功率和正確率。但目前也只有40%～50%的植入前胚胎能體外培養(yǎng)發(fā)育到囊胚期。二、卵裂球活檢方法活檢活檢對于胚胎的損傷是難免的, 尤其從4細胞期的胚胎中取出單個卵裂球后的一段時間, 其胚胎的發(fā)育會慢于正常, 取的越多則越明顯, 但對于8細胞期的活檢則普遍認為對胚胎的發(fā)育, 以及對出生后的成長過程影響不大［5］, 甚至有研究認為活檢可以促進囊胚的孵化。目前主要采取的方法是用Tyrode酸性液消化穿破透明帶, 然后從孔中插入活檢吸管吸出1個卵裂球, 或注人培養(yǎng)液使卵裂球從破孔疝出, 或在透明帶外加壓擠出, 另外從1997年開始又出現(xiàn)了使用激光穿孔后取出單個細胞的進展。主要以對胚胎發(fā)育影響最小為目的, 因而以往應(yīng)用的機械分離切割等對胚胎損傷較大的方法已基本淘汰。中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心比較了純水法、凍融法、堿法和蛋白酶K法4種細胞裂解方法，其擴增率分別為61%、79%、95%和91%，ADO率分別為35%、24%、8%和11%，堿法和蛋白酶K法的擴增效率高，可達臨床診斷要求，且其ADO率低于其他兩種方法［6］。三、PGD診斷技術(shù)對于分離得到的單個細胞或其它痕量DNA(trace DNA)樣品的分子遺傳學(xué)分析受到DNA量少的限制, 以至于經(jīng)過一次孤立的PCR無法達到比較基因組雜交(CDG)所需要的豐度, 目前主要的發(fā)展方向是遵循敏感、可靠、準確、識別/排除污染四原則, 探索可用于痕量大量擴增的方法和用于檢測少量樣品的技術(shù)。目前在PGD中應(yīng)用診斷技術(shù)方法主要為DNA聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）和熒光原位雜交（fluorescent in-situ hybridization, FISH）。（一）PCR技術(shù)(Ⅰ) 單細胞PCR1. 巢式PCR：因PGD的PCR起始模板來源于單個細胞，僅1～2 個拷貝，為增加擴增的敏感性，多采用巢式P C R 。其原理是首先設(shè)計一對針對目的基因的引物, 然后在此引物內(nèi)部再設(shè)計一對內(nèi)引物, 通過兩次PCR擴增, 獲得大量的目的基因片段, 巢式PCR靈敏度非常高, 能夠比較有效的擴增。 然而整套引物的設(shè)計比較繁瑣, 存在有多種類型的組合方式, 對于不同擴增產(chǎn)物的辨識存在一定困難。同時, 可能存在雜合子細胞中異常的來自父母雙方的等位基因一方不被擴增的情況, 也就是所謂的等位基因漏碼(allel dropout，ADO), Ray等［7］報道可以通過提高解鏈溫度來降低其發(fā)生率。另外增大取樣量以及選擇不同的穿孔液對于的ADO發(fā)生也有影響。 目前,國外地中海貧血的植入前診斷主要依靠巢式PCR 結(jié)合突變檢測技術(shù)。Vivian Chan等［8］進行的排除α地貧基因純合子的PGD中采用單細胞巢式PCR對82個胚胎中的126個卵裂球進行分析.平均等位基因脫扣率是10.2%PCR失敗率是12.7% 。通過檢測58個胚胎（70.%）有至少一個正常的等位基因，其中31個胚胎獲得移植，獲得一個三胎妊娠。孕18周時進行超聲檢查均正常并于孕34周時經(jīng)剖宮產(chǎn)3名正常嬰兒。國內(nèi)鄧婕、莊廣倫等進行β地中海貧血PGD的應(yīng)用報道中利用單細胞多重巢式PCR,可以同時檢測中國人常見的16種β地貧突變類型,單個淋巴細胞平均擴增效率為91.3% ,平均等位基因脫扣(ADO)率為17.0%。對4對夫婦進行4個周期PGD,共活檢33 個胚胎,獲得33 個卵裂球,其中30 個卵裂球擴增成功,擴增效率為90.9% ,ADO率為13.3%。26個胚胎經(jīng)PCR分析后獲得明確診斷,移植了8個胚胎,獲得1例臨床妊娠。孕17周時經(jīng)臍帶血穿刺,證實為完全正常胚胎,現(xiàn)已出生1名正常女嬰［9］。2. 熒光PCR自動測序或全自動熒光凝膠電泳：熒光PCR 采用熒光標記的引物、dNTP 或探針，針對特異的基因片段進行擴增，PCR產(chǎn)物經(jīng)自動DNA測序儀或掃描儀分析。 熒光PCR是為提高的確診率和降低ADO率而設(shè)計的, 即在進行PCR擴增時, 對兩個引物中的一個進行標記, 通過應(yīng)用熒光技術(shù), 使檢測的靈敏度比普通PCR高出一千倍以上，可以鑒別1～2bp的差異，可有效地避免等位基因偏性擴增，明顯降低等位基因的丟失率。熒光PCR中單次擴增的產(chǎn)物可供檢測，無需進行巢式PCR，可避免兩次擴增中污染的可能性。國內(nèi)李曉紅、周燦全等進行的α-地中海貧血PGD實驗中對 1例夫婦均為東南亞缺失型α 地中海貧血攜帶者 ,經(jīng)超排取卵、卵母細胞單精子顯微注射受精及胚胎細胞活檢 ,吸取的單個卵裂球采用針對α SEA基因的 gap PCR引物和熒光探針用熒光定量PCR技術(shù)進行診斷 ,將診斷為不致病的 3個胚胎進行宮腔內(nèi)移植。胚胎移植后 7周B超診斷單胎妊娠 ,18周羊膜腔穿刺產(chǎn)前診斷證實為不致病胎兒,獲得國內(nèi)首例α 地中海貧血胚胎種植前基因診斷后妊娠成功［10］。鄧婕、莊廣倫等進行的應(yīng)用熒光PCR技術(shù)檢測單細胞β地中海貧血基因的實驗中，應(yīng)用熒光PCR技術(shù)檢測單細胞β地中海貧血(β地貧)基因,并與巢式PCR相比較,發(fā)現(xiàn)160個淋巴細胞進行熒光PCR擴增,β地貧基因的平均擴增效率為92.5%,等位基因脫扣(ADO)率為8.8%； 240個淋巴細胞進行巢式PCR擴增,β地貧基因的擴增效率為91.7%,ADO率為15.8%.兩種方法的擴增效率沒有統(tǒng)計學(xué)差異,但熒光PCR的ADO發(fā)生率顯著低于巢式PCR的ADO發(fā)生率(P＜0.05) ［11］。熒光PCR的另一個優(yōu)點是在分析胚胎遺傳物質(zhì)的同時，可應(yīng)用多重PCR增加等位基因的標記物，如擴增與目的基因相連的短串聯(lián)重復(fù)序列STR(linked short tandem repeat)進行DNA指紋分析，或?qū)δ康幕騼?nèi)的單核苷酸多態(tài)性SNP(single nucleotide polymorphisms)進行分析，以鑒別是否為來自父母雙方的等位基因的產(chǎn)物，從而降低擴增污染DNA導(dǎo)致誤診的可能。中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心近年來將STR位點的檢測應(yīng)用于PGD的臨床診斷中，進行β-地中海貧血的PGD中同時擴增β珠蛋白基因及與β珠蛋白基因緊密連鎖的Hum THO1位點，有效的防止誤診［11］。熒光PCR還可以有效地鑒別ADO和優(yōu)勢等位基因擴增。優(yōu)勢等位基因擴增指一對等位基因中的一個擴增效率高于另一個，當(dāng)兩者的差異大于10倍時，則不能通過常規(guī)的PCR檢測方法檢測出非優(yōu)勢等位基因，因此容易被斷為ADO。而熒光PCR的高敏感性可以鑒別優(yōu)勢等位基因擴增和真正的ADO。鄧婕、莊廣倫等應(yīng)用熒光PCR對β-地中海貧血CD41-42突變基因進行檢測，單個淋巴細胞的ADO發(fā)生率比巢式PCR降低約1/3［11］。3.實時PCR與分子信標技術(shù)：實時PCR(real-time PCR)是結(jié)合分子信標技術(shù)(molecular beacons)發(fā)展起來的一種新型PCR, 其機理是利用兩末端結(jié)合有因熒光共振能轉(zhuǎn)化而相互碎滅的兩種標記熒光的引物探針報告熒光與熄滅熒光, 與目的基因結(jié)合并進行延伸反應(yīng), 繼之以核酸外切酶將探針的含報告基因(repoter gene)熒光的部分切除,這樣造成了報告熒光染料與熄滅熒光染料之間的空間距離, 從而檢測出熒光而當(dāng)樣品中不含有目的基因時, 則引物探針中的報告基因熒光部分不能被切除, 報告熒光液不能顯色。另外熒光強度尚有半定量的作用。Sanche等［12］將該技術(shù)用于單細胞水平檢測Y染色體上的高度保守的TSPY基因和17號染色體上的U2基因, 認為該技術(shù)具有高度的精確性, 是PGD發(fā)展中一個方便、可信的新進展。G.Kokkali等［13］及Christina Vrettou等［14］采用了real-time PCR技術(shù)進行了對β-地中海貧血的PGD實驗，均獲得了正常的臨床妊娠。4. 逆轉(zhuǎn)錄PCR：逆轉(zhuǎn)錄PCR（RT-PCR）將致病基因表達的信使RNA 反轉(zhuǎn)錄為cDNA，以cDNA為模板進行擴增，檢測目的基因有無異常。該方法已成功地用于Marfan 綜合征患者的PGD。不過RTPCR 雖然能夠提供較多的模板拷貝，但由于在胚胎發(fā)育早期很多基因并未轉(zhuǎn)錄，所以其在PGD中的應(yīng)用是非常有限的。5. 多重PCR：在同一PCR 反應(yīng)中加入多對引物，同時擴增同一模板的幾個區(qū)域或不同染色體的幾個位點，可同步完成多個基因位點的診斷。同時通過擴增跨越突變位點的DNA片段和與致病基因連鎖的多態(tài)性標記物，還具有監(jiān)測DNA污染和等位基因丟失而導(dǎo)致假陽性和假陰性結(jié)果，因為同時導(dǎo)致兩種擴增片段丟失的機會甚低。6. 原位PCR：該技術(shù)將原位雜交技術(shù)的定位能力與PCR 的敏感性結(jié)合起來，通過熱變溫循環(huán)，將寡核苷酸引物退火到染色體的DNA，然后實現(xiàn)熒光標記核苷酸摻入的特異DNA 序列的原位延伸。反復(fù)循環(huán)目的片段在染色體原位得以擴增，并可以通過熒光信號檢測進行分析，完成短小拷貝序列的快速細胞定位，檢測小于3~5kb 的DNA 序列差異。但原位PCR的等位基因脫失率較常規(guī)PCR更高，主要適用于高通量的檢測，而不是單細胞水平分析的PGD。（Ⅱ）全基因組擴增技術(shù)針對PGD模板量極少且限制檢測位點的難題而開發(fā)的全基因組預(yù)擴增技術(shù)也已成功地應(yīng)用于PGD中，使PGD時可同時檢測多個位點。1992年Zhang等［15］報道采用擴增前引物延伸法（primer extension preamplification，PEP）進行全基因組擴增。1999年Wells等［16］報道應(yīng)用變性寡核苷酸引物PCR(degenerate oligonucleotide premed PCR,DOP-PCR)擴增出的DNA量可用于超過100個獨立的PCR檢測。目前PEP和DOP-PCR技術(shù)是最常用來進行全基因組擴增的技術(shù)。1.引物延伸預(yù)擴增技術(shù) 引物延伸預(yù)擴增(PEP)是最早用于進行全基因組擴增的技術(shù), 其引物是由多個15個堿基組成的隨機引物的混合物, 在理論上這樣的引物有4種, 這些引物與模板結(jié)合后對全基因組進行擴增, 獲得大量產(chǎn)物后再對模板進行位點特異性PCR擴增或巢式PCR擴增, 據(jù)等Paunio等［17］試驗研究表明, 經(jīng)PEP后單細胞基因組的96%都得到有效擴增, 擴增效率在1000倍以上。經(jīng)PEP擴增后雖然增加了診斷所需的時間(﹥14小時), 但對于提高檢測的靈敏度以及合并多種遺傳學(xué)異常的診斷方面無疑是非常有利的。2002年中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心根據(jù)中國人常見的地中海貧血基因類型，建立可以同時檢測16種中國人常見的地中海貧血基因類型，建立可以同時檢測16種中國人常見的地中海貧血突變位點的PGD診斷系統(tǒng)，并應(yīng)用PEP進行全基因組擴增，然后分別進行性別及地中海貧血的診斷，總擴增效率為92.8%，平均診斷正確率為96.3%，不同引物之間的擴增效率和診斷準確率差異無顯著性。在β-地中海貧血的PGD中，4例病人的47個活檢胚胎有38個獲得明確診斷，其中8個胚胎正常，18個雜合子，異常胚胎12個，胚胎移植后獲得1例臨床妊娠，孕20周臍血檢測證實為正常雙胎［18］。2.簡并寡核昔酸引物PCR及標記隨機引物PCR等擴增技術(shù) 簡并寡核昔酸引物PCR(DOP-PCR)是一種最具應(yīng)用前景的全基因組擴增技術(shù),其引物設(shè)計比較特殊, 即在其5’和3’端的若干個位點使用隨機的堿基, 通常是5’*******NNNNNN******3’ 結(jié)構(gòu), 擴增產(chǎn)物的兩端都帶有引物序列, 并能繼續(xù)以類似隨機（如同PEP的隨機引物擴增）或在特定末端(如同PCR的選擇性特異擴增)與引物結(jié)合, 然后進行擴增。標記隨機引物PCR(Tagged-PCR,T-PCR), 則是設(shè)計引物時, 3’端是隨機的,5 ’端是不變的標記端, 第1輪擴增可以獲得5’ 端標記的擴增產(chǎn)物, 第2輪擴增則唯一是兩端都標記的產(chǎn)物, 多重延伸后再應(yīng)用專門針對標記引物設(shè)計的另一對引物進行進一步的PCR擴增。Wells等［16］, 比較了DOP-PCR、T-PCR、PEP、alu-PCR四種全基因組擴增技術(shù), 通過改進加入引物、核酸、酶的濃度, 以及調(diào)整加熱循環(huán)的條件等技術(shù)參數(shù), 得出了DOP-PCR在診斷染色體非整倍體異常和辨識X染色體的比較基因組雜交上具有明顯的優(yōu)勢, 其雜交信號強大而沒有缺失或過于突出, 尤其在擴增中結(jié)合熒光核昔酸應(yīng)用可以獲得很高的信號強度,T-PCR則在擴增的準確性上有較大優(yōu)勢。3.限制顯示技術(shù)擴增 限制顯示技術(shù)(RD-PCR)是一項最初用于差異顯示的新技術(shù), 雙鏈DNA經(jīng)特殊的限制型內(nèi)切酶切成限制型片段后與設(shè)計好的通用引物結(jié)合, 引物的3’ 端通過延伸一定數(shù)目的堿基(A,D ,C 或G ),將全基因組的擴增分成N=4n×（4n+1）/2個亞組, 每個擴增片段的長度穩(wěn)定在250～750bp, 這樣在擴增豐度上無很大差異, 而且擴增產(chǎn)物的大小比較均一, 適合進行多種遺傳病檢測的大規(guī)模雜交條件的控制。二、熒光原位雜交技術(shù)FISH的原理是將標記熒光的探針與固定在玻璃載玻片上細胞染色體或染色質(zhì)量的特異部位進行原位雜交，然后用熒光顯微鏡配合不同的濾光片觀察，從而判斷特定染色體的數(shù)目或其存在和缺失。目前多色FISH和多輪FISH均已應(yīng)用于PGD臨床可滿足胚胎常見染色體數(shù)目異常綜合征的篩查、平衡結(jié)構(gòu)異常和性染色體異常夫婦的胚胎染色體組成分析，同時通過性別檢測防止無法進行基因診斷的性連鎖疾病妊娠的發(fā)生。1.普通熒光原位雜交技術(shù)(FISH) FISH技術(shù)是細胞遺傳學(xué)與分子遺傳學(xué)結(jié)合的產(chǎn)物, 將制備好的熒光探針與培養(yǎng)分裂中期經(jīng)變性處理DNA雙鏈進行原位雜交, 然后應(yīng)用熒光顯微鏡配合不同的濾光片觀察結(jié)果, 常用于分析染色體異常。FISH技術(shù)具有較高的敏感性和分辨率, 而且還可以用于檢測間期染色體, 突破了傳統(tǒng)的同位素標記只能用于中期染色體的缺陷, 目前應(yīng)用CCD相機可提高的FISH分辨率, 激光共聚焦顯微鏡對更能從三維結(jié)構(gòu)上對雜交信號進行掃描和解讀。2.多色原位熒光技術(shù)(mFISH) 多種顏色的熒光素結(jié)合可以對更多的探針進行檢測, 在理論上n種熒光素混合可用于標記2n－1種組合方式, 5色熒光在理論上就可以檢測全部基因組的24個染色體。但該技術(shù)目前存在3個問題：單細胞水平操作效率不高；分裂間期、中期細胞的獲取存在困難；對于5個以上探針雜交結(jié)果的分析存在很大困難。四、PGD技術(shù)應(yīng)用存在的問題和前景PGD 技術(shù)不僅所需儀器及探針昂貴，技術(shù)難度大，而且還存在以下幾個方面問題：（1 ）單細胞分析技術(shù)，反應(yīng)模板DNA 量少，不能診斷嵌合體，易發(fā)外源性DNA 污染，檢測失敗和錯誤的風(fēng)險遠較常規(guī)的基因診斷高；（2）依靠并受制于IVF 技術(shù)，只有IVF 臨床能夠提供較多的優(yōu)質(zhì)的胚胎，才可施行胚胎活檢和遺傳學(xué)分析，只有擁有同步發(fā)育良好的子宮內(nèi)膜，分析后選擇移植的胚胎也有可能著床，PGD 才有成功的可能。因此，只有具備良好輔助生殖和分子診斷技術(shù)基礎(chǔ)的的生殖醫(yī)學(xué)中心才有能力進行臨床PGD。此外，PGD 技術(shù)本身又帶來了新的法律和倫理問題。不過，我們相信，隨著生殖醫(yī)學(xué)和分子生物學(xué)技術(shù)的不斷進步，相關(guān)法律的健全，地中海貧血基因分子基礎(chǔ)的闡明，PGD完全有可能成為一類常規(guī)的產(chǎn)前遺傳病診斷和篩查技術(shù)，人類一定能夠真正獲得從源頭控制地中海貧血等遺傳性疾病發(fā)生的能力。參考文獻1. 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