[摘要] 目的：探討胃癌細胞株MKN45在125I籽源的持續(xù)作用下發(fā)生凋亡的變化，包括細胞形態(tài)、早期凋亡率以及Bcl-2、Bax表達的變化，為臨床使用125I籽源治療胃癌提供實驗依據。方法：實驗組用7粒125I籽源所制成的園盤形狀照射源持續(xù)照射人胃癌細胞株MKN45，對照組則不予照射，72h后收集各組細胞，分別在光鏡、電鏡下觀察細胞形態(tài)， DAPI染色測細胞凋亡率，用流式細胞儀檢測細胞的早期凋亡率，RT-PCR檢測細胞內的Bcl-2、Bax的表達情況。結果：①實驗組各組細胞在光鏡、電鏡下能觀察到凋亡細胞的典型形態(tài)上的改變。②DAPI染色細胞凋亡率比對照組高(p﹤0.01)。③實驗組細胞的早期凋亡率比對照組高(p﹤0.01)。④RT-PCR檢測細胞內的Bax表達明顯增強(p﹤0.01)。⑤半定量PCR檢測Bax表達明顯增強，Bcl-2的表達減弱，實驗組的Bcl-2/ Bax的比值低于對照組(p﹤0.01)。結論：125I籽源持續(xù)照射能誘發(fā)人胃癌細胞株MKN45的凋亡， Bcl-2/ Bax的比值降低可能是人胃癌細胞株MKN45凋亡的機制之一。[關鍵詞] 125I籽源，輻射，人胃癌細胞株，凋亡，Bax，Bcl-2。[中圖分類號]Experimental Study on Apoptosis of Gastric Cancer Cell Line MKN45 Induced by Continuous Irradiation from Iodine-125 SeedsAbstractObjective:To investigate the apoptotic effect of iodine-125 seeds on gastric ————————*四川省衛(wèi)生廳科研課題（編號 080130）資助△ Corresponding author,E-mail:wxt1@medmail.com.cncancer cell line MKN45 and its changes in laboratory，including the changes of cellular morphosis, early apoptotic rate and Bal-2/Bax expression, and to provide further evidence for the clinical application of iodine-125 seeds on gastric cancer.Methods:Human gastric cancer cell line MKN45 in treatment group was continously exposed to discoid radiative sources made by seven iodine-125 seeds,which was not exposed while in control group .72 hours later,the gastric cancer cells in each group were collected, and observed respectively under light and electron microscope. Apoptotic rate were detected with DAPI staining. Early apoptotic rate was detected by flow cytometry(FCM).And Bal-2/Bax expression was detected by RT-PCR.Results: ①Typical morphologic changes of apoptotic cells could be observed under light and electron microscope in treatment group.②Apoptotic rate detected with DAPI staining in treatment group was higher than that in control group,P<0.01.③Early apoptotic rate in treatment group was higher than that in control group,P<0.01.④Increased intracellular Bax expression level detected by RT-PCR was in treatment group, P<0.01.⑤Detected by semi-quantitative RT-PCR, Bax expression level in treatment group highly incresed, while Bal-2 expression decreased.The ratio of Bal-2 to Bax in treatment group was lower than that in control group.Conclusion: Continously irradiation by iodine-125 seeds can induce apoptosis of human gastric cancer cell line MKN45.The decreasing ratio of Bal-2 to Bax may be one of the mechanism of human gastric cancer cell line MKN45’s apoptosis.Keywords : iodine-125 seed; radiation ;human gastric cancer cell line ; apoptosis ; Bax ;Bcl-2.125I籽源是將人造放射性核素125I吸附于銀絲或鈀絲上，再將其密封于鈦管內制作而成，在國外主要用于治療前列腺癌和顱內腫瘤。隨著我國125I籽源和三維計劃系統(tǒng)的成功研制，125I籽源已被廣泛用于臨床。目前有將125I籽源用于治療胃癌的臨床報道[1-6]，但125I籽源作用于胃癌細胞的分子機制如何，尚未闡明。為研究125I籽源作用于胃癌細胞的效果和機制，本研究通過將125I籽源持續(xù)照射人胃癌細胞株MKN45，觀察其實驗室變化，探討125I籽源作用于胃癌細胞的分子機制，為臨床使用125I籽源治療胃癌提供理論依據。1．材料和方法1．1 材料 高糖型(4500mg/L)DMEM培養(yǎng)液(Gibco公司)； 6711型125I籽源（寧波君安藥業(yè)科技有限公司）；小牛血清（蘭州民海生物）；超純水（Millipore公司Mili- 純水器，18.2m/cm）；人胃癌細胞株MKN45（ATCC）；DAPI染料（sigma公司）； AnnexinV-FITC細胞凋亡試劑盒（凱基生物科技發(fā)展有限公司）；流式細胞儀（BDFACSAria）（分析用FACSDiVa software）；Real time PCR detection system(iCycler iQ,Bio-Rad, USA)。1．2 方法1．2．1 細胞標本的制作 復蘇、培養(yǎng)人胃癌細胞株MKN45 ，并進行觀察、記數，在光學顯微鏡和倒置相差熒光顯微鏡下觀察實驗前后細胞的形態(tài)和細胞核的變化。藍染細胞率小于5%，證明細胞生長狀況良好，才進行實驗。取直徑35mm的培養(yǎng)皿21個，在其中央放置潔凈蓋玻片；將培養(yǎng)瓶內處于對數生長期的細胞進行消化、記數，以5×105個/ml的密度接種于直徑35mm的培養(yǎng)皿內，共接種21個皿。1．2．2照射模型制作 參照文獻[7] 自行設計125I籽源離體照射模型：在聚苯乙烯(polystyrene)材料上制作直徑35mm的圓，在圓周上等距離刻6個4.5mm×0.8mm的粒子槽，在圓心上刻1個4.5mm×0.8mm的粒子槽，將粒子放入并固定，見圖1。照射時將直徑35mm的培養(yǎng)皿對應于照射模型上的圓。每個照射模型和其培養(yǎng)皿構成的照射單元間，以0.25mm厚的鉛橡皮進行隔離防護。 圖1 125I籽源離體照射人胃癌細胞株MKN45Fig 1 Diagram for 125I seed radiation on human gastric cancer cell line MKN45 in vatro. A:Complete assembly showing cell dish on top of plaque inside protected container. B:Arrangement of seven seeds on the plaque.1．2．3實驗分組 將實驗分為3個組：對照組（a）、0.9mCi125I籽源組（b）和0.6mCi125I籽源組（c）。a組為3個細胞培養(yǎng)皿，不予照射。兩個125I籽源組各有9個細胞培養(yǎng)皿。在125I籽源照射下連續(xù)培養(yǎng)72h，后收集細胞。1．2．4 125I籽源對MKN45細胞凋亡的影響 采用胎盤藍染色法、DAPI染色法及電鏡觀察各組細胞的凋亡。熒光顯微鏡下觀察100個細胞，統(tǒng)計核物質固縮及形成“核著邊”的凋亡細胞數，觀察3次，計算出細胞凋亡的百分率。收集細胞5×105個，加PBS液2ml，2000rpm,5min離心，如此洗滌兩次。加入500μL Binding Buffer懸浮細胞，再加入5μL AnnexinV-FITC混勻，后加入5μL Propidium Iodide，混勻。 以不加AnnexinⅤ-FITC、PI的細胞作為空白對照管；以單加AnnexinⅤ-FITC、單加PI的兩管細胞作為熒光補償調節(jié)對照。 室溫、避光、反應15min，1 hour 內進行流式細胞儀（BDFACSAria）檢測，分析用FACSDiVa software。每個標本流式細胞儀檢測3次，計算細胞的早期凋亡率。1．2．5 Bcl-2、Bax mRNA的表達檢測 采用RT-PCR檢測細胞Bcl-2、 Bax mRNA表達情況。①反應體系：10×buffer(Mg2+ free) 3 l+MgCl2（25mmol/L）6 l+dNTP（2.5 mmol/L）3.6 l+上游引物（20 mol/L）0.5 l（Invitrogen,上海）+下游引物（20 mol/L）0.5 l+探針或染料（10 mol/L）0.5 l+Taq酶（5U/l）0.2 l（TaKaRa,大連）+ddH2O17.4 l+cDNA模板1 l+Calibration dye 0.3l 共30 l。②擴增條件如下： 94℃ 3min； 94℃ 20sec，51℃ 30sec，72℃ 30sec，共40個循環(huán)。③ 熔解曲線條件設置如下： 95℃ 1min，55℃ 1min，55℃ 10s,80個循環(huán)，每次循環(huán)增加0.5℃。④Bax引物為：5′GGATGATTGCCGCCGT3′和5′CCCAGTTGAAGTTGCCGT 3′，擴增片段長度為91bp,退火溫度為51℃。Bcl-2引物為：5’ACAGAGAACCATCCCTATT3‘和5‘GAGAGAATGTTGGCGTCTT3’， 擴增片段長度為401bp，退火溫度為51℃。內參照β-actin 的引物為：5’ AAGGCCAACCGCGAGAA3’和5’cctcgtagatgggcaca3’， 擴增片段長度為166bp，退火溫度為51℃。⑤結果處理：Bax的Real time PCR產物以相對定量表示。Real time PCR方法：目的基因的量=2－△△CT，在該公式中，Ct是熱循環(huán)儀檢測到反應體系中熒光信號的強度值，△△Ct = [CtGI(實驗組或處理組)-Ctβ-actin (實驗組或處理組)]- [Ct GI (對照組) - Ctβ-actin (對照組)]。GI是目的基因，校正樣品是任何被選做代表1倍目的基因表達量的樣品。 Bcl-2、Bax半定量PCR結果以半定量檢測的Bcl-2、Bax的光密度值與β-actin的比值作為結果統(tǒng)計。1．2．6 統(tǒng)計學方法：結果以均數±標準差表示，行單因素方差分析；方差不齊時采用秩和檢驗，各實驗小組之間的兩兩比較用LSD檢驗。Bax熒光定量PCR結果用t檢驗。α=0.05。2．結 果2．1 臺盼藍染色實驗結果 結果見表1、圖2。在對照組細胞中，臺盼藍染色可見正常細胞，沒有找到凋亡細胞；在實驗組細胞中可見大量早期凋亡細胞和典型的凋亡細胞圖象。3組細胞死亡率之間的差異,有統(tǒng)計學意義(p=0.006)；LSD兩兩比較，差異有統(tǒng)計學意義。表1 臺盼藍染色細胞死亡率Table 1 Cellular mortality detected with trypan blue stainingGroupnRank sum testPLSD test PabcControl125I seed(0.9mCi)125I seed(0.6mCi)927275.8778±.499445.0630±.281684.9259±.41193.0060.001.000.0010.046.000.0460（a）（b）圖2 臺盼藍染色顯示125I籽源（0.9mCi）組人胃癌細胞株MKN45Fig 2 Human gastric cancer cell line MKN45 by trypan blue staining.（a）Control group （b）125I seed（0.9mCi） group（A:Early apoptotic cell;B: Typical morphologic changes of apoptotic cell.）2．2 DAPI染色熒光顯微鏡觀察結果 對照組正常細胞核較大，圓形或橢圓形，呈淡藍色均勻或不均勻熒光,見圖3A。經125I籽源持續(xù)照射處理過的各組實驗組細胞中，均可見不同階段的凋亡細胞和凋亡小體圖象：細胞核明顯縮小，呈橢圓形、不規(guī)則形或點狀，呈藍色，可見較強的熒光， 見圖3B。有的核染色質深染呈裂紋狀，染色質邊聚；有的核高度深染凝聚、邊緣化；有的裂解為高度深染的小圓形或點狀碎片。各組間細胞凋亡率差異有統(tǒng)計學意義； 兩125I籽源組與對照組間差異均有統(tǒng)計學意義，但兩125I籽源組間差異無統(tǒng)計學意義；見表2。表2 各組細胞凋亡率、Bcl-2/BaxmRNA和Bax mRNA PCR結果Table 2 results of apoptotic rate and PCR for Bcl-2/BaxmRNA and Bax MrnagroupnApoptotic rate（%）Early apoptotic rate（%）Bcl-2/BaxmRNABax mRNAcontrol38.67±1.168.80±0.101.49±0.01125I seed(0.9mCi)913.67±1.58＊14.03±0.32＊1.32±0.13＊0.02±0.01125I seed(0.6mCi)914.00±1.87＊14.97±1.55＊1.15±0.18＊0.83±0.29△＊P＜0.05,compared with control group;△P＜0.05,compared with 125I seed(0.9mCi) group BA 圖3 DAPI染色顯示125I籽源（0.9mCi）組人胃癌細胞株MKN45Fig 3 Human gastric cancer cell line MKN45 by DAPI staining.（a） Control group （b）125I seed（0.9mCi） group2．3 流式細胞儀檢測細胞早期凋亡率結果 兩125I籽源組與對照組早期細胞凋亡率間差異有統(tǒng)計學意義，但兩125I籽源組間差異無統(tǒng)計學意義；見表2。2．4 電鏡結果 對照組可見正常形態(tài)的人胃癌細胞株MKN45和細胞結構（圖4），沒有發(fā)現凋亡細胞；而125I籽源組的細胞中則可見到核染色質邊集（圖5Ａ）、細胞器腫脹（圖5B）的早期凋亡細胞和細胞體積縮小、核皺縮（圖6）的凋亡細胞。 圖4 對照組正常胃癌細胞株MKN45（A內質網;B線粒體）放大8000倍Fig 4 Morphology of human gastric cancer cell line MKN45. Control group. Electron microscope.A: endocytoplasmic reticulum;B: cytochondriome.圖5 125I籽源（0.9mCi）組人胃癌細胞株MKN45的早期凋亡細胞（A：染色質;B：細胞器） 放大8000倍Fig 5 Early apoptotic cell. 125I seed（0.9mCi）group. Electron microscope.A:chromatin B:organelle圖6 125I籽源（0.9mCi）組人胃癌細胞株MKN45的凋亡細胞 放大8000倍Fig 6 Typical morphologic changes of apoptotic cell. 125I seed（0.9mCi） group. Electron microscope.2．5 Bcl-2/Bax mRNA表達半定量PCR結果 將對照組、0.9mCi組、0.6mCi組進行分析，兩125I籽源組與對照組間的差異有統(tǒng)計學意義, 但兩125I籽源組間的差異無統(tǒng)計學意義；見表2。2．6 Bax mRNA表達熒光定量PCR結果 0.9mCi125I籽源組和0.6mCi125I籽源組間Bax表達差異有統(tǒng)計學意義；見表2。3．討 論目前，關于125I籽源作用于胃癌細胞的分子機制如何，尚未闡明。已知的研究結果表明，輻射對細胞的損傷有兩種結果，間期死亡和凋亡[8] 。有學者報道[9]，低劑量率射線的照射下，凋亡是細胞死亡的主要機制。作為低劑量率的6711型125I籽源引起胃癌細胞死亡的主要途徑是靠直接殺傷或是誘導凋亡，尚沒有文獻報道。本實驗結果顯示，兩照射劑量組的臺盼藍染色細胞壞死率，不但沒有大于對照組，反而小于對照組，這說明胃癌細胞經125I籽源持續(xù)照射72小時后，細胞的死亡率并沒有增加。至于對照組的細胞壞死率為什么比照射組的高，我們分析是因為受到照射的培養(yǎng)皿內的細胞的分裂受到創(chuàng)傷，但尚未死亡，只是分裂速度下降而已；而對照組的細胞則因為沒有受到損傷，細胞分裂速度沒有受到影響，細胞的數量過快增長，代謝產物堆積過多造成了細胞的死亡。因此，125I籽源持續(xù)照射胃癌細胞，其作用不是直接殺死胃癌細胞。本實驗結果還顯示，實驗組的胃癌細胞在125I籽源模型持續(xù)72h照射后，相差顯微鏡觀察培養(yǎng)皿即可看見較多的凋亡細胞， DAPI染色和電鏡下均可以見到典型的處于各個階段的凋亡細胞，而對照組的細胞里卻缺乏凋亡細胞，這說明125I籽源照射后能誘發(fā)人胃癌細胞株MKN45的大量凋亡。DAPI染色和流式細胞儀檢測細胞凋亡率均顯示0.9mCi照射組和0.6mCi照射組的細胞凋亡率明顯高于對照組。目前，有國內外學者報道了125I 籽源作用前列腺癌、肝癌和乳腺癌的可能機制，至于125I籽源作用胃癌細胞的分子機制，尚未見報道。胃癌細胞凋亡的機制迄今尚未完全明了，已知的研究顯示有很多基因參與其調節(jié)，文獻報道Bcl-2和Bax與其較為密切[10,11]。已有的關于基因表達的研究顯示，Bcl-2生理功能是阻遏細胞凋亡，延長細胞壽命。Bax是Bcl-2家族中參與細胞凋亡的一個成員，當誘導凋亡時，它從胞液遷移到線粒體和核膜。Bcl-2與Bax兩者之間的比例決定了細胞的命運，若Bax占多數，則Bcl-2被抑制，凋亡被誘導，細胞死亡；反之則Bax受到抑制，細胞得以生存[12]。本實驗通過半定量PCR檢測發(fā)現，對照組的Bcl-2/Bax值要高于0.9mCi照射組和0.6mCi照射組。定量PCR檢測發(fā)現，0.9mCi照射組和0.6mCi照射組的Bax mRNA值與對照組相比明顯增高。Bcl-2、Bax mRNA的研究結果表明，胃癌細胞經過125I籽源照射后，細胞內Bax mRNA的表達上調，Bcl-2/Bax值下降。胃癌細胞凋亡的調控中，究竟是Bax mRNA的表達上調占主導，還是Bcl-2/Bax值下降為主，以往的研究顯示不清楚。本實驗的流式細胞儀檢測細胞早期凋亡率和DAPI染色測細胞凋亡率的結果，均顯示了0.9mCi照射組和0.6mCi照射組兩組之間細胞凋亡率的差異沒有統(tǒng)計學意義，兩組之間的 Bcl-2/Bax值差異也沒有統(tǒng)計學意義，但兩組之間的Bax值差異卻有統(tǒng)計學意義。也就是說，盡管兩照射組之間的Bax值有差異，但是兩照射組之間的細胞凋亡率值卻并沒有差異，說明細胞內單純Bax值差異跟細胞凋亡率之間沒有直接對應關系。實驗中兩照射組之間的Bcl-2/Bax值與細胞凋亡率之間則成對應關系。我們因此推測，Bcl-2/Bax值的下調，是胃癌細胞凋亡的調控機制之一；單純的Bax表達上調不是胃癌細胞凋亡的機制。臨床上治療胃癌時， 125I籽源活度大小的選擇，一直是人們關注的問題。選擇合適活度的125I籽源，在腫瘤細胞得到最大限度殺傷的同時，讓腫瘤周圍的正常組織的損傷降低到最小，就成了我們研究的課題。本實驗設計的0.9mCi照射組和0.6mCi照射組的研究結果顯示，兩個照射組的胃癌細胞的凋亡率和早期凋亡率雖然與對照組相比是增加了，兩照射組間的凋亡率和早期凋亡率值也有不同，但經LSD兩兩比較差異并沒有統(tǒng)計學意義。這就是說，雖然0.9mCi照射組比0.6mCi照射組的籽源活度增加了，但是照射效果卻并沒有增加。因此，臨床上在選擇125I籽源治療胃癌時，在0.6～0.9mCi之間選擇時，為了減少不必要的并發(fā)癥，應該選擇低活度0.6mCi的籽源。至于0.6mCi的籽源是不是治療胃癌的最佳的活度，還有待于做更進一步的研究。參考文獻1． 馬旺扣,駱永基,曹鐘華,等.125碘粒子組織內放療在腫瘤外科中的應用.陜西腫瘤醫(yī)學,2002,10(4):241-245.2. 王娟,隋愛霞,賈漪濤,等.單純放射性 125I粒子植入治療不能切除的Ⅳ期胃癌9例報告.中國實用外科雜志,2006,26(7):530-532. 3． 邵慶華,羅開元,楊鏞,等.胃腸道惡性腫瘤根治術中125碘放射性粒子近距離治療療效觀察.中國實用外科雜志,2002,22(9):541-542. 4. 毛文源,羅開元,邵慶華,等.125I粒子近距離組織間放射治療胃癌.中華胃腸外科雜志,2002,5(2):112. 5. 卜延志,徐月華,戴旭東.125I粒子術中植入與腹腔內化療聯(lián)合應用治療胃癌療效觀察.中國醫(yī)學研究與臨床,2006,4(6):50-51. 6. 廖 斌,李 念,徐爾侃,等.碘-125粒子組織間植入配合手術治療胃腸道惡性腫瘤.四川醫(yī)學,2007,28(2):199-200.7． Aird EG,Folkard M,Mayes CR,et al. 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