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江蘇省人民醫(yī)院

公立三甲綜合醫(yī)院

推薦專家

疾病： 急性上呼吸道感染
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急性上呼吸道感染科普知識 查看全部

靶向高通量測序在感染性疾病中的應(yīng)用現(xiàn)在臨床上用的宏基因二代測序檢查，即高通量測序檢查項目，在三甲醫(yī)院普遍被應(yīng)用，價格昂貴，而且屬于自費項目。我們來進一步認(rèn)識一下這項高通量測序檢查項目的詳細(xì)分類和最新檢測技術(shù)進展。感染性疾病是全球致殘和致死的主要疾病之一，對于感染性疾病致病性微生物的檢測一直是臨床上的重點。傳統(tǒng)的病原體檢測技術(shù)面臨培養(yǎng)陽性率低、時間長、難以檢出苛養(yǎng)菌等局限性、近年來，高通量測序（high-throughputsequencing,HTS）的快速發(fā)展給病原體的檢測帶來新的突破，HTS在臨床實驗室中最常見的應(yīng)用包括宏基因組高通量測序（metagenomicshigh-throughputsequencing,mHTS)、全基因組測序（wholegenmoesequencing,WGS)、靶向高通量測序（targetedhigh-throughputsequencing,tHTS）等。目前，mHTS應(yīng)用最為廣泛。mHTS測序深度大、覆蓋面廣、測序效率高，可以在一次測序過程中測出樣本中所有的核酸序列，在檢測出病原微生物的同時對病原體進行種屬鑒定。相較于傳統(tǒng)的病原學(xué)檢測，mHTS的優(yōu)勢如下：①更高的靈敏度和準(zhǔn)確性，彌補了傳統(tǒng)病原學(xué)檢測方法的不足：②更快的檢測速度，可以早期提供臨床信息；③更廣的檢測范圍，可以同時檢出臨床標(biāo)本中的細(xì)菌、真菌、病毒、非典型病原體和寄生蟲，在檢測罕見、新發(fā)病原體方面更具有優(yōu)勢：④檢測結(jié)果受抗菌藥物經(jīng)驗治療的影響小。mHTS的局限性如下：①檢測結(jié)果易受人源序列的影響：②同時只能進行單一的脫氧核糖核酸（deoxyribonucleicacid，DNA）或核糖核酸（ribonucleicacid,RNA）測序；③價格昂貴等；④結(jié)果解讀困難；等等。mHTS仍在不斷地創(chuàng)新和發(fā)展，tHTS的出現(xiàn)從技術(shù)原理上彌補了HTS在病原學(xué)診斷中的部分不足。一、靶向高通量測序的技術(shù)原理tHTS是一種基于HTS的靶向富集的測序技術(shù)，通過對目標(biāo)基因組感興趣區(qū)域（regionsofinterest,ROI）進行富集，確保ROI有足夠的測序深度和覆蓋度，這是確保HTS應(yīng)用有效的關(guān)鍵步驟，目前，tHTS的靶向富集技術(shù)主要分為2種：基于超多重聚合酶鏈反應(yīng)（polymerasechainre-action.PCR）擴增的PCR擴增法和基于探針雜交捕獲的探針雜交法。1．基于超多重PCR擴增的PCR擴增法其主要流程是針對感興趣的目標(biāo)基因區(qū)域，利用目的基因區(qū)域兩側(cè)的序列設(shè)計多重PCR引物進行擴增富集，并將這部分區(qū)域放大幾千倍并進行測序。在核酸序列數(shù)量和質(zhì)量有限的情況下，該方法也可以產(chǎn)生足夠的序列進行測序。通常需要多個引物同時工作，得到的擴增序列需要測序適配器連接完成文庫制備，之后進行測序分析。2．基于探針雜交捕獲的探針雜交法根據(jù)目的基因區(qū)域設(shè)計具有特異性序列的單鏈寡核苷酸（被稱為"探針"或者"誘餌")，這些探針可以是RNA或DNA，與特定基因組序列雜交后分離，以捕獲目標(biāo)基因組序列。捕獲成功后進行測序適配器連接和少量PCR循環(huán)，以富集成功連接的片段并進行測序分析。與DNA探針相比，RNA探針在與DNA序列結(jié)合時具有更好的雜交特性和更高的穩(wěn)定性，從而提高捕獲的總體效率。RNA相對不穩(wěn)定限制了其使用，而DNA探針應(yīng)用更為廣泛。以上2種方法對比，基于超多重PCR擴增的PCR擴增法具有核酸需求量低，工作流程更快、更簡單，脫靶測序率更低，適用于目的基因靶點較少的樣本，但其測序失敗率相對較高?；谔结橂s交捕獲的探針雜交法雖然無基因靶點數(shù)量的限制，且測序失敗率低，但其工作流程更加復(fù)雜、核酸需求量高?？偟膩碚f，上述這2種方法均適用于HTS目標(biāo)富集，具體選擇哪種方法，應(yīng)根據(jù)測序目的和測序條件綜合考慮。與mHTS相比：①tHTS針對特定的病原微生物序列進行擴增，可以減少甚至無視人源序列對檢測結(jié)果的影響；②tHTS可以同時進行DNA/RNA測序，可以一次檢測包括RNA病毒在內(nèi)的病原微生物；③由于tHTS的病原檢測圖譜是經(jīng)過篩選的，檢測病原微生物的種類有限，故所需成本更低。二、靶向高通量測序的臨床應(yīng)用1．靶向高通量測序?qū)Σ≡⑸锏臋z測效力傳統(tǒng)病原學(xué)檢測方法，靈敏度低、耗時長?，F(xiàn)有的分子診斷方法，如定量聚合酶鏈反應(yīng)（quantitativepolymerasechainre-action,qPCR）檢測范圍窄，mHTS在技術(shù)原理上仍存在諸多不足。tHTS作為新興的HTS，在技術(shù)原理上彌補了傳統(tǒng)病原學(xué)檢測的不足，改正了mHTS的一些缺陷。Li等設(shè)計了一個包括153種呼吸道感染病原體的tHTS測序平臺，可以覆蓋95％的常見呼吸道感染病原體。結(jié)果顯示，102例呼吸道感染患者中tHTS的檢出率為82.17%,mHTS為86.51%，兩者檢出率的差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.41)。tHTS的成本僅為mHTS的1/4，故在保持高靈敏度的基礎(chǔ)上，tHTS在成本方面更具有優(yōu)勢。tHTS可以同時進行DNA/RNA測序，一次測序就可以完成對細(xì)菌、真菌、病毒和非典型病原體的檢測。此外，tHTS還單獨檢出了鼻病毒，其在臨床應(yīng)用上更具實用性。臨床上常需要面對多種病原微生物引起的感染，這就需要一種能同時檢測多種微生物的技術(shù)手段。研究表明，Sanger測序在檢測多重感染標(biāo)本時，通常無法解釋檢測結(jié)果。雖然，mHTS有助于多重感染的鑒定，但是并不能有效區(qū)分定植菌和病原菌。近年來，有研究提出基于16SrRNA的HTS在多重微生物感染標(biāo)本中有準(zhǔn)確鑒定病原微生物種及定量細(xì)菌豐度的能力。Pitashny等進一步探索了基于16SrRNA的tHTS對多重感染的檢測效力。研究發(fā)現(xiàn)，在Sanger測序陰性的標(biāo)本中，tHTS檢測出8例陽性，均為多重細(xì)菌。Robin等納入了2146例臨床實踐中的組織和液體標(biāo)本，包括肺組織、漿膜液、骨組織、腦脊液、膿腫組織、心臟瓣膜等，分別使用培養(yǎng)方法、Sanger測序及tHTS對標(biāo)本進行檢測。在肺組織中，相較于Sanger測序，tHTS的陽性率提高了300%。多重感染標(biāo)本，tHTS具有強大檢測能力，故早期選擇tHTS具有重要臨床價值。tHTS對低載量微生物、苛養(yǎng)菌的檢出也具有優(yōu)勢。研究發(fā)現(xiàn)，利用靶向捕獲技術(shù)結(jié)合mHTS可以增加90%病毒核酸的載量，從而擴大目標(biāo)微生物檢測覆蓋度，提高檢測的可信度。研究表明，通過靶向捕獲富集后，檢出病毒的序列數(shù)增加了674倍，病毒基因組的覆蓋度從2.1%提升至83.2%。得益于覆蓋度的提高，捕獲的tHTS可以用于分析基因組變異度高達(dá)58％的指環(huán)病毒。由此可見，tHTS在一定程度上降低了檢驗結(jié)果的解讀難度，更適合在臨床上被廣泛使用。綜上所述，tHTS對于病原微生物的診斷效力不亞于現(xiàn)有分子診斷技術(shù)，且彌補了現(xiàn)有分子診斷技術(shù)的部分不足，在臨床應(yīng)用上具有更廣的適用范圍。此外，在不同類型的臨床樣本中，tHTS也被證明了其在診斷方面的潛能，具體的診斷效力仍需要更多針對性的研究來探索。2．靶向高通量測序?qū)δ退幓虻臋z測效力基于培養(yǎng)的藥敏試驗是臨床最常用檢測耐藥細(xì)菌的方法，但其過程煩瑣、需要專業(yè)人員解讀結(jié)果、靈敏度低。mHTS得到的微生物測序序列數(shù)不足樣本總序列數(shù)的5%，故無法勝任耐藥基因的解讀任務(wù)，而基于tHTS的新一代耐藥基因檢測技術(shù)將有助于臨床快速檢測耐藥基因。Wu等的研究比較了tHTS與表型藥敏試驗（phenotypicdrugsusceptibilitytesting,DST）對結(jié)核耐藥基因檢測的結(jié)果。結(jié)果顯示，tHTS的靈敏度和特異度分別為97.0％和99.1%，與DST結(jié)果高度一致?？梢?，tHTS對耐藥基因的檢測具有高度靈敏性。Sibandze等使用tHTS檢測患者的糞便標(biāo)本并同時進行耐藥性預(yù)測。56例結(jié)核患者中tHTS檢測出38例（68%)，同時38例陽性患者中的28例(74%）檢測出的結(jié)核分枝桿菌復(fù)合體耐藥性預(yù)測報告，與痰DST結(jié)果高度一致（k=0.82)。tHTS在檢測結(jié)核分枝桿菌同時可以檢測耐藥基因，極大地縮短了時間。另有研究發(fā)現(xiàn)，結(jié)核病患者，tHTS(75.5%）與結(jié)核分枝桿菌及利福平耐藥基因檢測（GeneXpertMTB/RIF,Xpert）靈敏度(74.5%）高度一致。因此，在結(jié)核的診斷中，tHTS具有一定的指導(dǎo)意義。Patricia等納人了201例支氣管肺泡灌洗液樣本，分別進行mHTS、tHTS及抗菌藥物敏感試驗（antimicrobialsusceptibilitytesting,AST)。結(jié)果顯示，mHTS的總體準(zhǔn)確性為67.1%,tHTS的總體準(zhǔn)確性為65.6%,2種檢測方法具有相似的檢測效力。其中，tHTS檢測出16種具有耐藥標(biāo)志物的潛在病原微生物，AST檢測出13種可評估表型耐藥性的病原微生物，tHTS檢測出的耐藥表型與藥敏試驗結(jié)果的一致率為54.8%。在1例大腸埃希菌與銅綠假單胞菌混合樣本中，藥敏試驗提示大腸埃希菌對美羅培南敏感，而tHTS檢測出BLAOXA基因。銅綠假單胞菌產(chǎn)生BLAOXA基因是本例基因型和表型矛盾的原因。該研究認(rèn)為，tHTS檢測耐藥基因需要考慮基因的突變、耐藥表型和基因型，以制定更完善的結(jié)果解讀方法。總之，現(xiàn)有的基于tHTS的耐藥基因檢測技術(shù)靈敏度不弱于傳統(tǒng)方法，且適用于多種標(biāo)本。未來隨著tHTS的，該技術(shù)將部分取代傳統(tǒng)藥物敏感試驗，在指導(dǎo)臨床用藥方面發(fā)揮重要作用。目前，tHTS還存在一些不足：①tHTS的檢測結(jié)果是根據(jù)已知病原體設(shè)計的，只能檢測設(shè)計目標(biāo)范圍內(nèi)的病原體，無法檢測出新發(fā)病原體，在臨床實踐中需要根據(jù)具體的需求設(shè)計針對性的病原體譜；②測序前的文庫制備需要大量人工和時間成本，且操作人員需要具有較高的專業(yè)水平。綜上所述，tHTS作為一種新興技術(shù)在呼吸系統(tǒng)感染的臨床應(yīng)用中具有極大的潛能。相較于mHTS,tHTS可以針對臨床初篩需求設(shè)計檢測范圍，覆蓋常見病原體、簡化解讀流程、靶向擴增針對性提高病原體的檢出可信度。未來，隨著tHTS的發(fā)展，其應(yīng)用有望得到更大的拓展。
《小兒霧化全知道：讓寶寶呼吸更順暢》在兒童的健康護理中，小兒霧化治療是一種常見且有效的手段。本文將全面介紹小兒霧化，幫助家長更好地了解這一治療方式，為寶寶的呼吸健康保駕護航。一、什么是小兒霧化？小兒霧化治療是通過霧化裝置將藥物分散成微小的霧滴或微粒，使其懸浮于氣體中，并進入呼吸道及肺內(nèi)，達(dá)到潔凈氣道、濕化氣道、局部治療及全身治療的目的。二、小兒霧化的原理霧化治療主要利用了氣體射流原理。霧化器將藥物溶液或混懸液轉(zhuǎn)化為微小顆粒，這些顆?？梢噪S著患者的呼吸進入呼吸道的不同部位，直接作用于病變部位。三、小兒霧化的適用病癥1.?呼吸道感染：如感冒、咳嗽、支氣管炎、肺炎等。2.?哮喘：霧化治療可以緩解哮喘發(fā)作時的呼吸困難、喘息等癥狀。3.?過敏性咳嗽：對于由過敏引起的咳嗽，霧化可以減輕炎癥反應(yīng)。4.?喉炎：特別是急性喉炎，霧化可以減輕喉部水腫，緩解聲音嘶啞、犬吠樣咳嗽等癥狀。四、小兒霧化的優(yōu)勢1.?藥物直達(dá)病灶：霧化治療可以使藥物直接作用于呼吸道病變部位，提高藥物的局部濃度，增強治療效果。2.?減少副作用：與口服或注射藥物相比，霧化治療的藥物劑量相對較小，減少了全身副作用的發(fā)生。3.?使用方便：小兒霧化治療通?？梢栽诩彝ブ羞M行，操作簡單方便，減少了患兒往返醫(yī)院的麻煩。4.?依從性好：對于年齡較小的寶寶，霧化治療相對容易接受，提高了治療的依從性。五、小兒霧化的注意事項1.?選擇合適的霧化器：應(yīng)根據(jù)寶寶的年齡、病情選擇合適的霧化器。一般來說，壓縮式霧化器效果較好，但價格相對較高；超聲霧化器價格便宜，但霧化顆粒較大，可能影響治療效果。2.?正確使用霧化器：在使用霧化器前，應(yīng)仔細(xì)閱讀說明書，掌握正確的使用方法。包括如何安裝霧化器、如何調(diào)節(jié)霧量、如何清潔霧化器等。3.?選擇合適的藥物：霧化治療的藥物應(yīng)根據(jù)寶寶的病情由醫(yī)生開具。家長不要自行購買藥物進行霧化治療，以免發(fā)生藥物不良反應(yīng)。4.?注意霧化時間和頻率：一般來說，每次霧化治療的時間為10-15分鐘，每天可進行2-3次。具體時間和頻率應(yīng)根據(jù)寶寶的病情和醫(yī)生的建議進行調(diào)整。5.?觀察寶寶的反應(yīng)：在霧化治療過程中，家長應(yīng)密切觀察寶寶的反應(yīng)，如出現(xiàn)呼吸困難、面色蒼白、口唇發(fā)紺等異常情況，應(yīng)立即停止霧化治療，并及時就醫(yī)。6.?做好霧化后的護理：霧化治療后，家長應(yīng)及時幫助寶寶清潔口腔和面部，以免藥物殘留引起口腔感染。同時，應(yīng)讓寶寶多喝水，促進痰液排出。六、如何選擇合適的霧化藥物？1.?支氣管擴張劑：如沙丁胺醇、特布他林等，可以緩解支氣管痙攣，改善呼吸困難。2.?糖皮質(zhì)激素：如布地奈德等，具有抗炎、抗過敏作用，可減輕呼吸道炎癥反應(yīng)。3.?祛痰藥：如氨溴索等，可以促進痰液排出，改善呼吸道通暢度。七、小兒霧化的誤區(qū)1.?霧化治療時間越長越好：并非如此，過長時間的霧化治療可能會導(dǎo)致寶寶疲勞、不耐受，甚至引起呼吸道黏膜水腫。2.?只要咳嗽就做霧化：霧化治療應(yīng)根據(jù)病情需要進行，不是所有的咳嗽都適合霧化治療。如果寶寶只是輕微咳嗽，沒有其他癥狀，可以先觀察，不必急于進行霧化治療。3.?自行調(diào)整藥物劑量：家長不要自行調(diào)整霧化藥物的劑量，以免影響治療效果或引起藥物不良反應(yīng)?？傊?，小兒霧化治療是一種安全、有效的治療方式，可以幫助寶寶緩解呼吸道疾病的癥狀，讓寶寶呼吸更順暢。家長在使用霧化治療時，應(yīng)選擇合適的霧化器和藥物，正確使用霧化器，注意觀察寶寶的反應(yīng)，做好霧化后的護理，避免陷入霧化治療的誤區(qū)。同時，家長還應(yīng)密切關(guān)注寶寶的病情變化，如有需要，及時就醫(yī)。