·基礎(chǔ)研究·不同頻率脈沖電磁場誘導(dǎo)人骨髓間充質(zhì)干細胞成骨分化的研究 宋晉剛 許建中 周強 羅飛 李洪鵬【摘 要】 目的 探討脈沖電磁場( PEMF)誘導(dǎo)人骨髓間充質(zhì)干細胞(MSCs)成骨分化的適合頻率。方法 選用場強1. 1 mT,頻率分別為5, 25, 50, 75, 100和150 Hz的PEMF作用于MSCs,每日30 min,連續(xù)作用21 d,光鏡下觀察細胞形態(tài)變化,電鏡下觀察細胞超微結(jié)構(gòu),酶化學(xué)法和放免技術(shù)檢測細胞的堿性磷酸酶(ALP)含量和骨鈣素(OC)表達情況。結(jié)果 不同頻率PEMF作用組均能誘導(dǎo)MSCs向成骨細胞分化;從 5~50 Hz頻段, PEMF的成骨誘導(dǎo)作用隨著頻率的增加而增強;從50~150 Hz頻段, PEMF的成骨誘導(dǎo)作用隨著頻率的增加而減弱。結(jié)論 頻率是PEMF誘導(dǎo)MSCs成骨分化的重要影響因素之一, 50 Hz可能為誘導(dǎo) MSCs體外成骨分化的適合頻率?!娟P(guān)鍵詞】 骨組織工程; 脈沖電磁場; 間充質(zhì)干細胞; 分化; 頻率 An exper imen ta l study on induc ing human mesenchyma l stem cells in to osteobla sts by d ifferen t frequenc ies of pulsed electromagnetic f ields SONG J in2gang, XU J ian2zhong, ZHOU Q iang, LUO Fei, L I Hong2peng. Departm ent of O rthopedics, South2W est Hospital, the 3 rd M ilitary University, Chongqing 400038, China 【Abstract】 Objective To study the suitable frequency of pulsed electromagnetic fields ( PEMF) for indu2 cing human mesenchymal stem cells (MSCs) differentiation. Methods The third generation of humanmesenchymal stem cells were irradiated by different frequencies of PEMF of 5, 25, 50, 75, 100, 150Hz, 1. 1mT, for 30min /d for 21 days. Morphological changes of the MSCs were observed under phase contrast microscope. The activity of Alkaline phosphatase (ALP) and the exp ression of osteocalcin (OC) were measured by enzymology and radioimmunitymeth2 ods to evaluateMSCs differentiation. Results Different frequencies of PEMF emp loyed in this study showed differ2 ent effects in inducingMSCs into osteoblasts. The differentiation ofMSCswas increasingwhen the frequency of PEMF was increased gradually from 5Hz to 50Hz, and then decreasing when the frequency of PEMF was increased from 50Hz to 150Hz. Conclusion Frequency of PEMF was one of the most important factors in inducingMSCs differen2 tiation. This study indicated that 50Hzwas the suitable frequency of PEMF for inducingMSCs into osteoblast in vitro. 【Key words】 Bone tissue engineering; Pulsed electromagnetic fields; Mesenchymal stem cells; Differ2 entiation; Frequency 骨組織工程是利用組織工程的原理與技術(shù)來促進骨細胞的增殖與分化,生成活體骨組織,可用于骨缺損的修復(fù)和再生,有望解決臨床修復(fù)大范圍骨缺損的難題[ 1 ] 。骨髓間充質(zhì)干細胞(mesenchymal stem cell, MSCs)是目前廣泛用于構(gòu)建組織工程骨的種子細胞, 經(jīng)體外擴增后,常規(guī)采用化學(xué)誘導(dǎo)的方法使其向成骨細胞分化,與支架材料形成復(fù)合物,進而構(gòu)建組織工程骨。有研究表明,脈沖電磁場( pulsed electromagnetic fields, PEMF)可促進成骨細胞的增殖分化、生長因子的分泌、細胞外基質(zhì)的合成,啟動骨的重建,加速骨的發(fā)育,促進骨的形成等[ 2, 3 ] 。因此,研究PEMF對MSCs 的成骨誘導(dǎo)作用對于構(gòu)建組織工程骨有重要意義。本實驗通過研究不同頻率的PEMF對MSCs體外成骨分化的影響,以期找出其成骨誘導(dǎo)的適合頻率,為新型生物反應(yīng)器的研制以及進一步研究PEMF促進MSCs增殖分化的機制提供實驗依據(jù)。材料和方法一、主要試劑與儀器主要試劑有: Percoll液( Sigma, 美國) 、1 ∶1 的 DMEM /F12 (Hyclone,美國) 、胎牛血清(Hyclone,美國) 、ALP檢測試劑盒(南京建成生物研究所) 、骨鈣素放免試劑盒(北京中國原子能研究院) 。主要儀器有: UV751GD 紫外/可見分光光度計(上海儀器總廠) 、可調(diào)試脈沖電磁作用儀(解放軍后勤工程學(xué)院) 。 ·134· 中華物理醫(yī)學(xué)與康復(fù)雜志2005年3月第27卷第3期 Chin J PhysMed Rehabil, March 2005, Vol. 27, No. 3 二、方法 1. MSCs的分離與培養(yǎng)無菌抽取20 ~30 歲健康志愿者兩側(cè)髂骨骨髓 5~10 ml,肝素抗凝。將采集到的骨髓用1. 073 g/ml Percoll液分離,以5 ×105 / cm2 的密度接種于培養(yǎng)瓶內(nèi), 加含15%胎牛血清的DMEM /F12 培養(yǎng)液, 置 37℃、5% CO2 飽和濕度培養(yǎng)箱內(nèi)常規(guī)培養(yǎng)。待細胞融合成單層并鋪滿瓶底80%后,以0. 25%胰蛋白酶消化,按1 ∶3 傳代,用含10%胎牛血清的培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。 2. 不同頻率PEMF的作用取第3代MSCs消化離心,吹打制成細胞懸液,分為對照組與PEMF作用組。PEMF作用組又根據(jù)頻率不同分為5, 25, 50, 75, 100和150 Hz作用組。每組以 1 ×104 / cm2 的密度接種于12 孔培養(yǎng)板中, 同時以 5. 0 ×105 /ml的濃度接種于50 ml培養(yǎng)瓶中, 每瓶 2 ml。將不同頻率的PEMF 作用組置于PEMF 的 Helmho Iz線圈中,兩線圈呈對偶式,間距10 cm,經(jīng)霍爾效應(yīng)測磁儀測得場強均勻性及穩(wěn)定性良好。通過引線將線圈置于培養(yǎng)箱中,設(shè)定場強為1. 1 mT,頻率分別為5, 25, 50, 75, 100和150 Hz,作用時間每日30 min, 連續(xù)作用21 d。對照組細胞置于同等條件下的培養(yǎng)箱中,不加PEMF作用。三、觀測指標(biāo) 1. 形態(tài)學(xué)觀察每日在倒置相差顯微鏡下觀察細胞形態(tài)變化及生長情況,并于傳代培養(yǎng)的第1, 3, 5, 7, 14和21天拍照記錄。 2. 超微結(jié)構(gòu)觀察 MSCs經(jīng)PEMF作用,細胞鋪滿瓶底約80%時消化離心,用PBS洗滌2次, 2. 5%戊二醛固定,不同濃度的丙酮依次脫水,環(huán)氧樹脂包埋,行常規(guī)超薄切片,以醋酸雙氧鈾2構(gòu)橡酸鉛雙染色,在透射電鏡下觀察不同頻率的PEMF作用組和對照組細胞的超微結(jié)構(gòu)。 3. 堿性磷酸酶( alkaline phosphatase,ALP)活性測定分別于脈沖電磁場作用的第3, 6, 9, 12和15天, 取出各組12孔培養(yǎng)板,消化離心,收集細胞, PBS洗滌 2次,調(diào)整細胞濃度至1 ×105 /ml,加入0. 5% Triton2 X100, 4℃冰箱中放置12 h。采用超聲破碎細胞使其完全裂解。取50 μl細胞裂解液,按試劑盒操作說明依次加入試劑,用分光光度計在520 nm波長處檢測其吸光度(A)值,計算ALP活性,并繪制成曲線。 4. 骨鈣素(osteocalcin,OC)檢測分別于實驗的第7, 14和21天,取出各組50 ml培養(yǎng)瓶,經(jīng)胰酶消化后,取1 ×106 個細胞,離心后加入 1 ml PBS與Trito2X100,按1∶1混合, 4℃冰箱中過夜, 粉碎,送西南醫(yī)院核醫(yī)學(xué)科,采用放免法測定細胞內(nèi) OC的含量。根據(jù)放射免疫競爭結(jié)合原理,放射性標(biāo)記物125 I 2骨鈣素和樣品中所含骨鈣素與有限量的骨鈣素抗體競爭性結(jié)合,γ計數(shù)器可測定沉淀物cpm (每分鐘計數(shù),放射性物質(zhì)量的單位) ,以標(biāo)準(zhǔn)曲線計算樣品 OC的含量。 5. 鈣結(jié)節(jié)染色 MSCs經(jīng)PEMF作用,待培養(yǎng)板中出現(xiàn)圓形或卵圓形結(jié)節(jié)后,取出蓋玻片,用PBS洗滌3 次, 75%酒精固定30 min,將固定后的細胞玻片置于茜素紅染液中染色5~10 min, 1%醋酸溶液快速沖洗,不同濃度的乙醇依次脫水,二甲苯透明,中性樹脂封片,攝像記錄。四、統(tǒng)計學(xué)分析應(yīng)用SPSS 11. 0統(tǒng)計軟件,采用單因素方差分析、 F檢驗進行統(tǒng)計學(xué)分析。組間數(shù)據(jù)采用Tukey法進行多重比較, P < 0. 05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié) 果一、倒置相差顯微鏡觀察第3代細胞接種后4 h完成貼壁, 24 h后貼壁細胞開始分裂增殖。經(jīng)PEMF連續(xù)作用5 d的MSCs較對照組密度高、體積大,呈三角形、多角形或鱗形,胞漿中含有較多的基質(zhì)成分和顆粒狀物質(zhì)(圖1, 2) 。不同頻率的PEMF作用組間細胞形態(tài)無明顯差別。隨培養(yǎng)時間的延長,細胞逐漸匯合成鋪路石狀,進而出現(xiàn)重疊生長,基質(zhì)堆積, 3周后基質(zhì)礦鹽沉積并融合成圓形或卵圓形的鈣化結(jié)節(jié),結(jié)節(jié)周圍的細胞呈放射狀分布 (圖3) 。二、超微結(jié)構(gòu)觀察透射電鏡下觀察到經(jīng)PEMF作用的MSCs較為成熟,核漿比例小,胞質(zhì)內(nèi)有豐富的細胞器,如線粒體、粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體等(圖4 ) ; 而對照組的 MSCs較為幼稚,細胞核較大,核漿比例大,細胞器較少(圖5) 。圖1 對照組MSCs傳代培養(yǎng)第5天顯微鏡下觀( ×100) 中華物理醫(yī)學(xué)與康復(fù)雜志2005年3月第27卷第3期 Chin J PhysMed Rehabil, March 2005, Vol. 27, No. 3 ·135·三、ALP活性檢測將各組MSCs ALP活性繪制成曲線,可見PEMF 作用第3天,不同頻率的PEMF作用組MSCs的ALP 活性即較對照組增強,且隨著作用時間的延長,ALP活性增強更為明顯,于第12天達高峰,第15天時基本穩(wěn)定,但仍明顯高于對照組水平( P < 0. 05) ;不同頻率的 PEMF作用組的MSCsALP活性不一, 50 Hz作用組明顯高于其它頻率作用組( P < 0. 05,圖6) 。圖6 各組MSCsALP活性曲線注:不同頻率的PEMF作用組與對照組相應(yīng)時間點比較, P < 0. 05; 50 Hz作用組與其它頻率作用組相應(yīng)時間點比較, P < 0. 05四、OC定量檢測 FEMEs作用第7 天, 不同頻率的PEMF 作用組 MSCs的OC 開始出現(xiàn)少量表達, 對照組無表達; 第 14天,不同頻率的PEMF作用組MSCs的OC含量增高,而對照組仍無表達;第21天,對照組OC出現(xiàn)少量表達,不同頻率的PEMF作用組MSCs的OC含量明顯高于對照組( P < 0. 01) 。PEMF作用頻率不同,細胞 OC含量不一, 50 Hz作用組OC含量明顯高于其它頻率作用組( P < 0. 05,表1) 。表1 不同頻率PEMF作用MSCs的OC含量測定 ( ng/ml, x- ±s) 組 別 OC含量 7 d 14 d 21 d 對照組0 0 0. 99 ±0. 13# PEMF作用組 5 Hz作用組0. 62 ±0. 12 1. 24 ±0. 16 6. 16 ±0. 22 3 # 25 Hz作用組0. 65 ±0. 13 1. 43 ±0. 23 8. 01 ±0. 28 3 # 50 Hz作用組0. 73 ±0. 12 1. 62 ±0. 24 14. 80 ±0. 25 3 75 Hz作用組0. 72 ±0. 14 1. 48 ±0. 15 11. 36 ±0. 23 3 # 100 Hz作用組0. 71 ±0. 08 1. 30 ±0. 13 6. 21 ±0. 22 3 # 150 Hz作用組0. 61 ±0. 07 1. 18 ±0. 16 5. 25 ±0. 25 3 # 注:與對照組比較, 3 P < 0. 01;與50 Hz作用組比較, # P < 0. 05 五、茜素紅鈣結(jié)節(jié)染色 MSCs經(jīng)PEMF作用21 d后,基質(zhì)礦鹽沉積并融合成圓形或卵圓形的鈣化結(jié)節(jié),結(jié)節(jié)周圍的細胞呈放射狀分布,茜素紅鈣結(jié)節(jié)染色呈陽性,可見橘紅色鈣結(jié)節(jié)。對照組鈣結(jié)節(jié)染色呈陰性。討 論 構(gòu)建理想的組織工程骨,首先要有生物學(xué)特性較佳的種子細胞。間充質(zhì)干細胞來源于中胚層,屬于成體干細胞,具有很強的增殖能力和多向分化潛能[ 4 ] , 是目前常用的種子細胞,其成骨分化作用受細胞因子、激素、物理因子等多種因素的影響。 ·136· 中華物理醫(yī)學(xué)與康復(fù)雜志2005年3月第27卷第3期 Chin J PhysMed Rehabil, March 2005, Vol. 27, No. 3 PEMF作為一種非侵入性療法在骨折延遲愈合及骨不連的治療中均取得了滿意療效,現(xiàn)在已經(jīng)被用于治療先天性骨缺損、骨壞死、骨移植及脊柱椎體融合術(shù)后等骨科疾病。研究表明, PEMF能廣泛地介導(dǎo)細胞外基質(zhì)的合成,增強成骨細胞ALP的表達,促進OC及膠原的合成與分泌[ 5 ] ,而MSCs又是骨修復(fù)過程中形成成骨細胞的重要始祖細胞之一, 因此我們推測 PEMF能夠?qū)SCs產(chǎn)生類似的生物學(xué)效應(yīng),并促進成骨。這一推論在本實驗室的前期工作中已得到了證實[ 6, 7 ] 。在電磁場的各項參數(shù)中,頻率對電磁場所產(chǎn)生的生物學(xué)效應(yīng)有較大的影響。有研究認為,電磁場產(chǎn)生生物學(xué)效應(yīng)的頻率范圍大約在1~100 Hz[ 8 ] 。骨骼系統(tǒng)的內(nèi)生性活動頻率范圍在步態(tài)頻率( 1~5 Hz)到肌肉收縮的動力頻率(10~100 Hz)間變化。Lee等[ 9 ]認為,最有效的電磁場頻率范圍應(yīng)接近機體正常功能活動頻率。我們參考Bassett 等[ 10 ] 關(guān)于不同參數(shù)的 PEMF對骨折愈合影響的報道及相關(guān)文獻, 在1 ~ 150 Hz頻率范圍間選擇5, 25, 50, 75, 100和150 Hz頻段,研究不同頻率PEMF作用對MSCs向成骨細胞分化的作用,以期找出誘導(dǎo)MSCs成骨分化的適合頻率。本研究結(jié)果顯示,倒置相差顯微鏡下觀察到經(jīng) PEMF作用的MSCs體積明顯較對照組大,呈三角形、多角形或鱗形,細胞內(nèi)顆粒狀物質(zhì)增多,基質(zhì)分泌旺盛。透射電鏡觀察到,經(jīng)PEMF作用的MSCs較為成熟,分化程度較高;而對照組的MSCs較為幼稚,分化程度低。3周后形成圓形或卵圓形的礦化小結(jié),經(jīng)茜素紅染色為陽性。ALP是成骨細胞的早期標(biāo)志酶,在成骨過程中水解磷酸酯,為羥基磷灰石的沉積提供必要的磷酸,有利于成骨,可標(biāo)志成骨分化的開始[ 11 ] ; OC是成骨細胞特異性合成和分泌的一種非膠原蛋白, 在鈣離子存在的條件下,與羥磷灰石結(jié)合并穩(wěn)定其構(gòu)象,是向成骨細胞分化的最具特征性的標(biāo)志物[ 12 ] 。因此,ALP和OC是反映成骨細胞在體外分化為成熟骨細胞及基質(zhì)鈣化的兩個重要指標(biāo)[ 13 ] 。本研究同時發(fā)現(xiàn),不同頻率的PEMF作用組細胞第3日即可檢測到 ALP的表達,并隨著時間延長,表達水平逐漸增高,提示細胞的成骨分化已經(jīng)開始; 1周后出現(xiàn)OC的表達, 3 周后達到較高水平,與礦化小結(jié)出現(xiàn)的時間相一致。而對照組ALP活性始終很低, OC幾乎沒有表達。這證明MSCs經(jīng)PEMF作用后,可向成骨細胞分化。不同頻率的PEMF作用組間比較發(fā)現(xiàn), PEMF誘導(dǎo)MSCs 成骨分化的效果與作用頻率有關(guān):從5~50 Hz頻段, 隨著頻率的增加,其成骨誘導(dǎo)作用逐漸增強;從50~ 150 Hz頻段,隨著頻率的增加,其成骨誘導(dǎo)作用逐漸減弱。我們推測,頻率是PEMF成骨誘導(dǎo)的重要影響因素之一, PEMF的作用頻率不同,對細胞的成骨誘導(dǎo)作用不一, 50 Hz可能為誘導(dǎo)體外MSCs向成骨細胞分化的適合頻率。關(guān)于不同頻率的PEMF促進MSCs成骨的生物學(xué)機制,還有待日后進一步深入探討。參 考 文 獻 1 Robert F. Tissue engineers build new bone. Science, 2000, 289: 14982 1500. 2 方真華,吳華,馬偉明. 50Hz電磁場對小鼠骨髓間充質(zhì)干細胞增殖的影響. 中華物理醫(yī)學(xué)與康復(fù)雜志, 2004, 26: 124. 3 Diniz P, Shomura K, Soejima K. Effects of pulsed electromagnetic field ( PEMF) stimulation on bone tissue like formation are dependent on the maturation stages of the osteoblasts. Bioelectromagnetics, 2002, 23: 3982 405. 4 PittengerMF,Mackay AM, Beck SC, et a1. Multilineage potential of a2 dult human mesenchymal stem cells. Science, 1999, 284: 1432147. 5 Lohmann CH, Schwartz Z, Liu Y, et al. Pulsed electromagnetic field stimulation ofMG63 osteoblast2like cells affects differentiation and local factor p roduction. J 0 rthop Res, 2000, 18: 6372646. 6 趙敏,許建中,周強. 脈沖電磁場促進人骨髓間充質(zhì)干細胞成骨的研究. 中國矯形外科, 2004, 12: 4392443.7 趙敏, 許建中, 周強, 等. 脈沖電磁場誘導(dǎo)人骨髓間充質(zhì)干細胞向成骨細胞分化的研究. 中華物理醫(yī)學(xué)與康復(fù)雜志, 2005, 27: 528. 8 Muehsam DJ, Pilla AA. The sensitivity of cells and tissues to exogenous fields: effects of target system initial state. Bioelectrochem Bioenerg, 1999, 48: 35242. 9 Lee JH, Mcleod KJ. Morphologic responses of osteoblast2like cells in monolayer culture to ELF electromagnetic fields. Bioelectromagnetics, 2000, 21: 1292136. 10 Bassett CA,ValdesMG, Herandez E. Modification of fracture repairwith selected pulsing electromagnetic fields. J Bone Joint Surg, 1982, 64: 8822892. 11 Aubin JE,Liu F,Malaval L, et al. Osteoblast and chondroblast differen2 tiation. Bone, 1995, 17: 77283. 12 LevyMM, Joyner CJ,VirdiAS, et al. Osteop rogenitor cells ofmature hu2 man skeletalmuscle tissue: an in vitro study. Bone, 2001, 29: 3172322. 13 Owen TA, AronowM, Shalhoub V, et al. Progressive development of the rat osteoblast phenotype in vitro: recip rocal relationship s in exp ression of genes associated with osteoblast p roliferation and differentiation during formation of the bone extracellularmatrix. J Cell Phsiol, 1990, 143: 4202 430. (修回日期: 2005201220) (本文編輯:吳 倩) 中華物理醫(yī)學(xué)與康復(fù)雜志2005年3月第27卷第3期 Chin J PhysMed Rehabil, March 2005, Vol. 27, No. 3 ·137·
中國矯形外科雜志 2004年12月第12卷第23、24期 Orthop J Chin , Vol. 12 ,No. 23、24 December 2004 ·1867 ··實驗研究·宋晉剛 許建中 周 強 羅 飛 李洪鵬摘 要 目的: 探求脈沖電磁場(pulsed electromagnetic fields , PEMF) 促進人骨髓間充質(zhì)干細胞(human mesenchymal stem cells , hMHCs) 增殖的適合頻率。方法: 選用場強1. 1 mT, 頻率分別為5、25、50、75、100、150Hz 的PEMF 刺激hMSCs , 30min/ d , 光鏡觀察細胞形態(tài), MTT法和流式細胞技術(shù)檢測細胞增殖水平及生長周期。結(jié)果: 各頻率組PEMF刺激均能促進MSCs 增殖; 頻率不同, 促增殖的效應(yīng)不一, 其中50Hz 頻段效果最為顯著, 生長曲線比對照組明顯前移, S 期細胞百分比(28. 89 ±0. 25) %較對照組(13. 57 ±0. 55) %增高107 %。結(jié)論: 頻率是PEMF 促進hMSCs 增殖的重要影響因素之一, 50Hz 為促進hMSCs 增殖的適合頻率。關(guān)鍵詞 脈沖電磁場; 間充質(zhì)干細胞; 頻率; 增殖中圖分類號 R687 文獻標(biāo)識碼 A 文章編號 1005 - 8478 (2004) 23、24 - 1867 - 03Effect of pulsed electromagnetic fields on accelerating human mesenchymal stem cells proliferation by different frequency∥SONG Jin2gang , XU Jian2zhong , ZHOU Qiang , et al . Department of Orthopaedics , Southwest Hospital , the Third Military Medical University , Chongqing400038Abstract Objective :To research the suitable frequency of pulsed electromagnetic fields (PEMF) on human mesenchymal stem cells (hMSCs)proliferation. Method :The third generation hMSCs were irradiated by different frequency PEMF of 5 ,25 ,50 ,75 ,100 ,150Hz , 1. 1 mT,30min/ d. The method of MTTwas employed to evaluate the level of proliferation. The parameter regarding the variation of the cell cycle was detected with the flow cytometry(FCM) . Result : Different effect on accelerating MSCs proliferation by different frequency PEMF. The significant effect was at the frequency of 50Hz. The percentage of cells at the S phase (28. 89 ±0. 25) was increased 107 % compared with that of the control group (13. 57 ±0. 55) . Conclusion :Frequency is one of the most important factor on accelerating MSCs proliferation ,and 50Hz is the suitable frequency of PEMF accelerating MSCs proliferation in vitro.Key words Pulsed electromagnetic fields (PEMF) ; Mesenchymal stem cells (MSCs) ; Frequency ; Proliferation△基金資助:國家高技術(shù)研究發(fā)展計劃(863) 重大專項《組織工程技術(shù)修復(fù)長骨缺損及人工皮膚的研發(fā)》(2003AA205020) ;重慶市科技攻關(guān)項目《組織工程骨與軟骨優(yōu)化制備及應(yīng)用研究》(2003 - 13 - 6) ; 西南醫(yī)院創(chuàng)新基金:人MSCs 體外快速擴增及誘導(dǎo)分化修復(fù)骨缺損的臨床研究(2002 - 15)作者單位:第三軍醫(yī)大學(xué)西南醫(yī)院骨科, 重慶市 400038作者簡介:宋晉剛(19762) ,男,四川省綿陽人,醫(yī)師,碩士在讀。研究方向:骨組織工程和脊柱外科。電話: (023) 65398052 E2mail :sjgfelix@163. net 骨髓間充質(zhì)干細胞(mesenchymal stem cell , MSCs) 作為一種成體干細胞, 具有極大的可塑性及多向化潛能, 是體外構(gòu)建組織工程骨常用的種子細胞。目前種子細胞的體外擴增需要3 周左右時間, 如何使種子細胞快速、優(yōu)質(zhì)擴增是構(gòu)建組織工程骨所面臨的緊要問題。 本實驗旨在研究不同頻率段脈沖電磁場(pulsed electromagnetic fields , PEMF) 刺激對體外MSCs 增殖的作用, 以期找出促進MSCs 增殖的適合頻率范圍, 為應(yīng)用PEMFs 促進MSCs快速擴增, 研制新型生物反應(yīng)器以及進一步研究PEMFs 促進MSCs 增殖的機制提供實驗依據(jù)。1 材料與方法1. 1 主要試劑與儀器Percoll 分離液(Sigma 公司, 美國) , DMEM/ F12 (1∶1) 培養(yǎng)基(Hyclone 公司, 美國) , 優(yōu)質(zhì)胎牛血清(Hyclone 公司,美國) , 四甲基偶氮唑藍(MTT) (Sigma 公司, 美國) , 酶聯(lián)反應(yīng)檢測儀(DG3022A 型, 華東電子管廠) , 流式細胞儀(Becton Dickinson , 美國) , 可調(diào)試脈沖電磁刺激儀(由解放軍后勤工程學(xué)院陳俊斌教授提供)1. 2 方法1. 2. 1 hMSCs 的分離與培養(yǎng) 無菌抽取20~30 歲健康志愿者兩側(cè)髂骨骨髓5~10ml ,肝素抗凝。用1. 073 g/ ml Percoll 液梯度離心, 以5 ×105/ cm2個細胞接種于培養(yǎng)瓶, 加含15 %胎牛血清的DMEM/ F12 培養(yǎng)液, 置37 ℃, 5 %CO2 飽和濕度培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。待原代細胞鋪滿瓶底80 % , 以0. 25 %胰蛋白酶消化, 按1∶3 傳代, 用含10 %胎牛血清的培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。1. 2. 2 不同頻率PEMF 刺激hMSCs 取第三代hMSCs 消化離心, 吹打制懸, 分為對照組和不同頻率PEMF 刺激組, 每組以1 ×104/ Cm2 接種于50ml 培養(yǎng)瓶及以5 ×103/ ml , 200ul/ 孔接種于96 孔培養(yǎng)板中。將刺激組置于PEMFs 的HelmhIz 線圈中, 兩線圈呈對偶式, 間距10cm ,經(jīng)霍爾效應(yīng)測磁儀測得場強均勻性及穩(wěn)定性良好。通過引線將線圈置于培養(yǎng)箱中, 設(shè)定場強1. 1 mT, 頻率分別為5、25、50、75、100、150Hz , 刺激時間30min/ d。對照組細胞置于同等條件下的培養(yǎng)箱內(nèi), 不加PEMFs 刺激。1. 2. 3 MTT法檢測細胞活性及生長曲線 每天PEMFs 刺激結(jié)束后, 取各組96 孔板, 每孔加入5mg/ ml MTT溶液20μl , 繼續(xù)培養(yǎng)4h 后吸棄孔內(nèi)上清液, 加入二甲亞砜(DMSO) 150μl/ 孔, 電動振蕩儀震動10min 使沉淀充分溶解后, 選擇490nm波長, 每板設(shè)一不含細胞的調(diào)零孔,在酶聯(lián)免疫檢測儀上測定各孔的光吸收OD 值。以時間為橫軸, 光吸收OD 值為縱軸繪制細胞生長曲線。1. 2. 4 流式細胞儀檢測細胞周期 刺激組與對照組培養(yǎng)瓶細胞接種后第5d , 細胞融合近80 % , 消化離心, 各組待測細胞用PBS 洗滌2 次, 迅速注入預(yù)冷的75 %乙醇, 振蕩混勻以1 ×106 個細胞密度懸浮固定細胞, 4 ℃過夜。經(jīng)熒光染料染色后, 流式細胞儀488nm波長檢測, 獲得DNA 含量分布組方圖和細胞凋亡比例。以增殖指數(shù)(proliferation index , PI) 分析PEMFs 對MSCs 分裂增殖水平的影響, 同時進行DNA 倍體分析。PI = [ (S + G2/M) / ( GO/G1 + S + G2/M) ] ×100 %。1. 2. 5 統(tǒng)計學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 11. 0 統(tǒng)計軟件, 采用單因素方差分析, F 檢驗對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學(xué)處理。各頻率組間數(shù)據(jù)采用Tukey 法進行多重比較, P < 0. 05 認為差異具有顯著性意義。2 結(jié) 果2. 1 形態(tài)學(xué)觀察 倒置相差顯微鏡逐日觀察hMSCs 生長情況和形態(tài)特征。傳代細胞于接種后4h 完成貼壁, 24h 后貼壁細胞開始分裂增殖, 部分區(qū)域形成細胞集落, 細胞呈均勻一致的長梭形外觀。3d 后經(jīng)PEMFs 刺激的hMSCs 形態(tài)比對照組大, 數(shù)目校對照組多, 排列更為緊密; 各頻率刺激組間細胞形態(tài)無明顯差別, 數(shù)目有所不一, 以50Hz 刺激組細胞密度最大。2. 2 對hMSCs 增殖水平的影響 經(jīng)細胞增殖與活性的MTT 檢測, 各刺激組與對照組OD值繪制成生長曲線如圖1。由圖中可見, PEMFs 刺激后的hM2SCs 增殖能力比對照組增強, 刺激組生長曲線較對照組前移,并且峰值增高。刺激頻率不同, 細胞增殖速度不一, 以50Hz刺激組明顯快于其他頻率刺激組( P < 0. 05 ) 。圖1 不同頻率PEMF 刺激MSCs 生長曲線(n = 12 , 各刺激組與對照組相比較, P < 0. 05 )2. 3 對hMSCs 細胞周期的影響 經(jīng)流式細胞儀檢測, 各PEMFs 刺激組樣本均未發(fā)現(xiàn)有DNA 倍體異常的細胞(diploid : 100 %) ; 各實驗組細胞周期檢測結(jié)果見表1。PEMF 刺激后的hMSCs 細胞周期發(fā)生了改變,S期細胞百分比較對照組增高; 刺激頻率不同, 細胞周期改變不一, 其中50Hz 頻段S 期細胞百分比(28. 89 ±0. 25) %較對照組(13. 57 ±0. 55 ) %增高107 %。各頻率刺激組間作多重比較, 50Hz 頻率顯著高于其他頻段組( P < 0. 05) 。這種改變與MTT方法測定的結(jié)果是相吻合的。表1 流式細胞儀檢測不同頻率PEMF 刺激后MSCs 細胞周期組 別G0 + G1 細胞周期( x ±s)SG2 +M PI 值對照組82. 93 ±0. 32 13. 57 ±0. 55 3. 5 ±0. 54 17. 075Hz 組70. 34 ±0. 25 21. 65 ±0. 26 8. 01 ±0. 32 29. 6625Hz 組69. 07 ±0. 26 26. 09 ±0. 30 4. 83 ±0. 28 30. 9250Hz 組63. 86 ±0. 45 28. 89 ±0. 25 8. 05 ±0. 63 36. 1675Hz 組65. 95 ±0. 30 26. 58 ±0. 45 7. 48 ±0. 50 34. 06100Hz 組72. 54 ±0. 56 21. 60 ±0. 63 5. 86 ±0. 42 27. 46150Hz 組74. 31 ±0. 72 20. 44 ±0. 60 5. 25 ±0. 45 25. 69 n = 5 ,各實驗組與對照組相比較, P < 0. 053 討 論 利用組織工程的原理與技術(shù)促進骨系細胞的增殖與分化, 生成活體骨組織用于骨缺損的修復(fù)和再生, 有望解決臨床修復(fù)大范圍骨缺損的難題。構(gòu)建理想的組織工程骨首先要有生物學(xué)特性較佳的種子細胞。間充質(zhì)干細胞來源于中胚層, 是目前常用的種子細胞, 雖然具有很強的自我復(fù)制能力, 但由于細胞數(shù)量少, 在骨髓中的密度低, 大約只有十萬分之一, 采用常規(guī)的培養(yǎng)方法, 難以在短期獲得大量優(yōu)質(zhì)的細胞來滿足構(gòu)建組織工程骨的需要。研究表明, 脈沖電磁場( pulsed electromagnetic fields ,PEMFs) 可啟動骨的重建, 加速骨的發(fā)育; 促進成骨細胞的增殖、生長因子的分泌、細胞外基質(zhì)的合成; 促進骨的形成和成熟等[1~3 ] 。MSCs 是骨修復(fù)過程中形成成骨細胞的重要始祖細胞之一, 因此我們推PEMFs 能夠?qū)SCs 產(chǎn)生一系列生物學(xué)效應(yīng), 并促進成骨。這一推論在本實驗室前期工作中得到了初步證實4 ,5 ] 。然而刺激的頻率不同, 是否會對細胞增殖及細胞周期產(chǎn)生不同的影響? 在組織工程骨的構(gòu)建中我們應(yīng)該選擇怎樣的合適頻率范圍? 選擇適當(dāng)?shù)膮?shù)對促進MSCs 的體外擴增及新型生物反應(yīng)器的研制有重要意義。 頻率對電磁場產(chǎn)生的生物學(xué)效應(yīng)有較大影響。研究認為, 電磁場產(chǎn)生生物學(xué)效應(yīng)的頻率范圍大約在1~100Hz[6 ] 。骨骼系統(tǒng)的內(nèi)生性活動頻率范圍在步態(tài)頻率(1~5Hz) 到肌肉收縮的動力頻率(10~100Hz) 間變化, Lee 等[7 ] 認為最有效的電磁場頻率范圍應(yīng)接近機體正常功能活動頻率。我們參考Bassett 等[8 ]關(guān)于不同參數(shù)PEMF 對骨折愈合影響的報道及相關(guān)文獻, 在1~150Hz 頻率范圍選擇5、25、50、75、100、150Hz 頻段, 研究不同頻率PEMFs 刺激對MSCs 體外增殖的作, 以用期找出促進hMSCs 增殖的適合頻率。 倒置相差顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn), 經(jīng)PEMF 刺激的MSCs 密度在細胞融合成單層之前明顯較對照組高。MTT 法測定的原理是活細胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能夠?qū)ⅫS綠色的MTT 降解成藍紫色的結(jié)晶并沉積細胞中, 而死細胞無此功能。利用流式細胞儀檢測細胞周期, S 期細胞百分比升高, 表明細胞的DNA 合成速度增高, 細胞增殖加速。通過以上檢測發(fā)現(xiàn),PEMF 的生物學(xué)效應(yīng), 在細胞水平上, 表現(xiàn)為促進細胞的增殖; 在染色體DNA 水平上, 表現(xiàn)為對細胞周期的影響, 提高細胞的S 期百分比。5~150Hz 頻率段PEMF 均能促進MSCs 體外增殖, 各頻率刺激組間作多重比較, 發(fā)現(xiàn)50Hz 頻段促增殖效應(yīng)顯著高于其他頻段組( P < 0. 05 ) 。從5~50Hz , 隨著頻率的增加, PEMF 促MSCs 增殖作用逐漸增強; 從50~150Hz ,隨著頻率的增加, PEMF 促MSCs 增殖作用逐漸減弱。 實驗表明, 頻率是脈沖電磁場促進hMSCs 增殖的重要影響因素之一, 刺激頻率不同, 促進細胞增殖的效應(yīng)不一,50Hz 為刺激促進MSCs 增殖的適合頻率。本實驗為骨髓間充質(zhì)干細胞體外快速擴增提供了新的思路和依據(jù), 并為新型生物反應(yīng)器的設(shè)計提供適合的頻率參數(shù)。關(guān)于PEMFs 促進MSCs增殖的生物學(xué)機制, 我們將在以后的研究中進一步探討。參考文獻:[1 ] Lohmann CH , Schwartz Z, Liu Y, et al . Pulsed electro - magnetic fieldstimulatiion of MG63 osteoblast - like cells affects differentiation and localfactor production[J ] . Orthop Res ,2000 ,18 (4) :637~646.[2 ] Diniz P ,Shomura K, Soejima K. Effects of pulsed electromagnetic field(PEMF) stimulation on bone tissue like formation are dependent on thematuration stages of the osteoblasts [ J ] . Bioelectromagnetics , 2002 , 23(5) :398~405.[3 ] Torricelli Paola , Fini M, Giavaresi G. Biomimetic PMMA - based bonesubstitutes : A comparative in vitro evaluation of the effects of pulsed elec2tromagnetic field exposure [J ] . Biomedical Materials Research ,2003 ,64(1) : 182~188.[4 ] 趙敏,許建中,周強. 脈沖電磁場對人骨髓間充質(zhì)干細胞增殖及細胞周期的影響[J ] . 中國臨床康復(fù),2004 ,8 (2) :234~235.[5 ] 趙敏,許建中,周強. 脈沖電磁場促進人骨髓間充質(zhì)干細胞成骨的研究[J ] . 中國矯形外科雜志,2004 ,12 (6) :439~443.[6 ] Muehsam DJ ,Pilla AA. The sensitivity of cells and tissues to exogenousfields : effects of target system initial state[J ] . Bioelectrochemistry and Bioenergetics ,1999 ,48 :35~42.[7 ] Lee JH , Mcleod KJ . Morphologic responses of osteoblast21ike cells inmonolayer culture to EL F electromagnetic fields[J ] .Bio electromagnetics,2000 ,21 :129~136.[8 ] Bassett CA ,Valdes MG, Herandez E.Modification of fracture repair withselected pulsing electromagnetic fields[J ] . J Bone Joint Surg ,1982 ,64 :882~892.(收稿:2004207217 修回:2004209213)中國矯形外科雜志 2004年12月第12卷第23、24期 Orthop J Chin , Vol. 12 ,No. 23、24 December 2004 ·1869 · 1994-2009 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net
sjgfelix@163.com 13990169502短篇論著椎體成形術(shù)治療老年胸腰椎爆裂性骨折宋晉剛 苗 艷① 崔易坤* 尹振宇 黃海鋒(四川省綿陽市中心醫(yī)院脊柱外科,綿陽 621000)①(四川省綿陽市人民醫(yī)院康復(fù)中心,綿陽 621000)*通訊作者,E-mial:sjgfelix@163.com[摘要] 目的 探討經(jīng)皮椎體成形術(shù)治療老年骨質(zhì)疏松引起的胸腰椎爆裂性骨折的臨床效果。方法:2010年1月~2012年10月,對25例不伴有明顯神經(jīng)癥狀的胸腰椎爆裂性骨折的老年患者行經(jīng)皮椎體成形手術(shù)治療。術(shù)前結(jié)合體位復(fù)位,術(shù)中根據(jù)骨折特點個體化穿刺及注入骨水泥,有效固化椎體、恢復(fù)椎體高度、糾正后凸成角。術(shù)后1、6、12月隨訪疼痛視覺模擬評分(VAS)、傷椎高度恢復(fù)率、傷椎后凸Cobb角。 結(jié)果:所有患者術(shù)后即可獲得椎體穩(wěn)定,腰痛VAS評分較術(shù)前明顯降低(2.5±0.9 vs. 9.2±0.8,P=0.000),椎體高度恢復(fù)(85.2%±4.4% vs. 80.3%±4.1%,P=0.000),后凸Cobb角減?。?.1o±2.1o vs. 11.4o±2.4o,P=0.000),23例獲得隨訪,術(shù)后12個月疼痛VAS評分進一步降低,術(shù)后6、12個月椎體高度、后凸Cobb角無明顯丟失。 結(jié)論:經(jīng)皮椎體成形術(shù)可用于治療老年骨質(zhì)疏松爆裂性骨折,安全有效,但需要謹慎選擇適應(yīng)證及個體化制定手術(shù)方案。[關(guān)鍵詞]:椎體成形術(shù);骨質(zhì)疏松;爆裂性骨折;骨水泥;微創(chuàng)Percutaneous vertebroplasty in treatment of osteoporotic thoracolumbar burst fractureSong Jingang, Miao Yan, Cui Yikun, et al.Mianyang Sicuan,621000,P.R.China;Department of Orthopaedics,Central Hospital of Mian Yang.Abstract: objective To explore the feasibility and clinical effect of percutaneous vertebroplasty in treatment of osteoporotic thoracolumbar burst fracture. Methods From January 2010 to October 2012, the 25 cases of osteoporotic thoracolumbar burst fracture without neurological sign were choosed. Position reset before operation, individualized puncture and injection of bone cement based on the characteristics of fracture in operation, effective cure vertebral body to restore vertebral body height and corrected convex Angle.Pain and disability were measured by visual analog scale (VAS), height of fractured vertebra and the Cobb′s angle on sagittal plane were measured by preoperation,postoperation and at the last follow up. Results 23 patients were followed up. The pain were disappear, VAS is significantly lower preoperatively (2.5±0.9 vs. 9.2±0.8, P=0.000). The height of the fracture vertebra (85.2%±4.4% vs. 80.3%±4.1%, P=0.000) and the Cobb′s angle (8.1o±2.1o vs. 11.4o±2.4o, P=0.000) were significant improved from preoperation (P<0.05). there="" was="" no="" significant="" difference="" in="" the="" following-up="" p="">0.05). No symptomatic complication was recorded in all patients. Conclusions Percutaneous vertebroplasty is an effective treatment of thoracolumbar burst fracture of osteoporotic, but need to choose the indication carefully and making the operation plan individual. Key words: Percutaneous vertebroplasty;Osteoporosis; Burst fracture ; Bone cement; minimally invasive經(jīng)皮椎體成形術(shù)(percutaneous vertebroplasty,PVP)自20世紀(jì)90年代應(yīng)用于臨床,目前是治療骨質(zhì)疏松性椎體壓縮骨折的有效方法。老年骨質(zhì)疏松引起的胸腰椎骨折大多為壓縮性骨折,但也有不少為爆裂性骨折,這部分患者曾被許多文獻視為PVP的禁忌證或相對禁忌證。我科自2006年開展PVP微創(chuàng)手術(shù),2010年1月~2012年10月采用PVP治療老年人胸腰椎爆裂性骨折25例,效果滿意,現(xiàn)報道如下。1 臨床資料與方法1.1 一般資料本組25例,男17例,女18例。年齡60~89歲,平均72歲。跌傷10例,車禍傷8例,提重物損傷7例。均有外傷后劇烈腰痛,腰部活動受限,傷椎棘突叩壓痛明顯。手術(shù)在傷后1周內(nèi)完成。術(shù)前常規(guī)行胸腰段正側(cè)位X線片、CT及MRI檢查,了解骨折是否為新鮮骨折及椎體后壁是否完整、是否合并椎管狹窄。均為新鮮骨折(MRI脂肪抑制像呈高信號),骨折椎體T11 2例,T12 3例,L1 4例,L2 8例,L3 7例,L4 1例。椎體壓縮程度10%~25%,后凸Cobb角8°~13°。椎體后壁完整,無椎管狹窄。骨密度T值2.5~3.5。入選標(biāo)準(zhǔn):年齡>60歲;雙能X線骨密度測定,參照骨質(zhì)疏松診斷標(biāo)準(zhǔn)[1],骨密度T值>2.5;骨折為骨質(zhì)疏松引起,排除椎體轉(zhuǎn)移性腫瘤發(fā)生病理性骨折;骨折椎體CT檢查,骨折類型為爆裂性骨折,椎管占位<20%,不伴有神經(jīng)癥狀;MRI加脂肪抑制成像,MRI脂肪抑制像呈高信號,提示椎體骨折為新鮮骨折;骨折部位正側(cè)位X線片檢查,測量椎體高度,壓縮<30%,后凸成角<15°。1.2 方法1.2.1 設(shè)備及器械 一次性椎體成形器械包(成都光大醫(yī)療器械有限公司),包括穿刺針、擴張?zhí)坠?、工作通道、擴髓鉆等;骨水泥(聚甲基丙烯酸甲酯,PMMA,德國Heraeus Medical GMBH公司);數(shù)字減影設(shè)備(ALLURA-FD20,荷蘭飛利浦公司)。1.2.2 手術(shù)方法 入院后平臥硬床,骨折部位加墊后仰輔助復(fù)位。術(shù)前肌注布桂嗪100 mg以減輕術(shù)中疼痛。俯臥過伸位,數(shù)字血管減影(digital substraction angiography,DSA)定位確定骨折椎體。常規(guī)消毒鋪巾,2%利多卡因局部麻醉,尖椎開孔,穿刺針經(jīng)傷椎上關(guān)節(jié)突下外緣進入椎弓根,根據(jù)生理角度調(diào)整傾角及夾角,沿椎弓根骨性通道進入椎體后壁。繼續(xù)進針2~3 mm,抽出穿刺針內(nèi)芯,置入導(dǎo)針,沿導(dǎo)針置入擴張?zhí)坠芎凸ぷ魍ǖ?,?jīng)工作通道將擴髓鉆緩慢鉆入椎體骨質(zhì)擴髓。工作通道要求置于椎體中前份,比單純壓縮性骨折位置靠前。經(jīng)濟條件許可的患者可加用球囊擴張,輔助塌陷的椎體復(fù)位并形成硬殼,減少骨水泥滲漏機率。將拉絲期骨水泥緩慢注入復(fù)張后的骨折椎體內(nèi),DSA術(shù)中監(jiān)視,根據(jù)骨水泥分布控制推注速度,調(diào)整工作通道深度。如有較大的骨折碎塊,可在注入骨水泥前用明膠海綿進行封堵,待骨水泥彌散滿意后停止注入。全程監(jiān)測患者生命體征。1.2.3 術(shù)后處理 術(shù)后平臥休息24小時,待穿刺點無滲血后戴腰圍保護下床,防止跌倒。繼續(xù)抗骨質(zhì)疏松藥物正規(guī)治療,口服阿侖膦酸鈉、骨化三醇、含維生素D2的鈣片3~6個月。術(shù)后1、6、12個月定期隨訪,攝正側(cè)位X線片,測量椎體前緣高度變化,對術(shù)前、術(shù)后椎體高度恢復(fù)率、脊柱后凸Cobb角、疼痛緩解程度及并發(fā)癥進行評價。1.2.4 觀察指標(biāo) ①疼痛程度:采用視覺模擬評分(visual analog score,VAS),0分為無痛,10分為劇痛。②傷椎高度恢復(fù)率:傷椎前緣高度與其上下正常椎體前緣高度和的平均值之比。③后凸Cobb角:側(cè)位X線片上確定后凸與正常移行部椎體,上方在移行椎體上緣連線劃垂線,下方在移行椎體下緣連線劃垂線,兩垂線的夾角。1.2.4 數(shù)據(jù)處理 采用SPSS11.0軟件,計量資料采用x±s表示,采用One-way ANOVA檢驗,兩兩比較采用LSD檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。2 結(jié)果25例均順利完成手術(shù),穿刺點出血5~10 ml。其中雙側(cè)穿刺3例,單側(cè)穿刺22例。手術(shù)時間30~90 min,平均50 min。每個椎體注入骨水泥3.0~7.5 ml,平均6.0 ml。術(shù)中出現(xiàn)骨水泥滲漏6例,其中滲漏至椎間盤內(nèi)2例,椎旁3例,椎旁靜脈1例,均無明顯臨床癥狀。無椎管內(nèi)滲漏。所有患者術(shù)后即可獲得椎體穩(wěn)定,腰痛VAS評分較術(shù)前明顯降低,椎體高度恢復(fù),后凸Cobb角減小,23例獲得隨訪,術(shù)后12個月疼痛VAS評分進一步降低,術(shù)后6、12個月椎體高度、后凸Cobb角無明顯丟失,見表1。2例術(shù)后短暫下肢神經(jīng)癥狀(下肢放射性疼痛、麻木),直腿抬高試驗陽性,經(jīng)脫水及營養(yǎng)神經(jīng)治療1周后消失。術(shù)后X線及CT復(fù)查,傷椎外形及高度基本恢復(fù)正常,骨水泥填充滿意,傷椎后緣骨塊無椎管內(nèi)移位。3 討論經(jīng)皮椎體成形術(shù)(percutaneous vertebroplasty,PVP)最早于20世紀(jì)80年代提出,能即刻穩(wěn)定骨折、強化椎體、恢復(fù)脊柱序列、緩解疼痛、早期功能鍛煉、減少并發(fā)癥。與傳統(tǒng)開放手術(shù)比較,具有創(chuàng)傷?。ń?jīng)皮穿刺,不損傷肌肉、血管、韌帶等組織結(jié)構(gòu)),對患者全身情況干擾?。ň植柯樽?,手術(shù)時間短,創(chuàng)傷小,對心肺功能影響?。?,效果顯著(術(shù)后即刻緩解疼痛),恢復(fù)快(術(shù)后無須長期臥床,可以早期功能鍛煉)等優(yōu)點,被廣泛用于治療老年骨質(zhì)疏松性椎體壓縮性骨折。老年人胸腰椎爆裂性骨折被許多文獻列為PVP的禁忌證或相對禁忌證[2]。這類患者大多有嚴(yán)重的骨質(zhì)疏松,內(nèi)固定手術(shù)可能出現(xiàn)拔釘或松動;患者由于高齡,大多合并慢性支氣管炎、肺氣腫、冠狀動脈粥樣硬化性心臟病等心肺疾患,開放手術(shù)風(fēng)險大,而如果選擇保守治療,不僅痛苦時間長,恢復(fù)慢,長期臥床還會使老年人面臨更多危及生命的并發(fā)癥如感染、深靜脈血栓、腦卒中等。隨著脊柱微創(chuàng)外科技術(shù)的迅速發(fā)展,椎弓根穿刺技術(shù)的提高,以前一些手術(shù)絕對禁忌證成為相對禁忌證。近年來,有學(xué)者采用PVP治療骨質(zhì)疏松性椎體爆裂骨折,取得較滿意的療效[3,4]。對老年爆裂性骨折病例的選擇,我們在嚴(yán)格遵守PVP適應(yīng)證的基礎(chǔ)上要求:①年齡>60歲,<60歲者一般行內(nèi)固定手術(shù)治療。②采用雙能X線骨密度測定,參照骨質(zhì)疏松診斷標(biāo)準(zhǔn),骨折為骨質(zhì)疏松引起,排除椎體轉(zhuǎn)移性腫瘤發(fā)生病理性骨折。③骨折椎體CT檢查,骨折類型為爆裂性骨折,椎管占位<20%,不伴有神經(jīng)癥狀。如椎管占位>20%,或伴有神經(jīng)癥狀,PVP手術(shù)可能會加重椎管占位或加重神經(jīng)癥狀。④MRI脂肪抑制像呈高信號提示椎體骨折為新鮮骨折。如為陳舊性骨折,不宜行PVP治療。⑤術(shù)前測量骨折椎體高度,椎體壓縮<30%,后凸成角<15°。如椎體壓縮>30%、后凸成角>15°,PVP手術(shù)很難恢復(fù)椎體高度及正常的脊柱序列。如果椎體壓縮>30%,可行球囊擴張椎體后凸成形術(shù)(percutaneous kyphoplasty,PKP)治療,能有效恢復(fù)椎體高度。⑥球囊位置要求置于椎體中前份,較單純壓縮性骨折靠前,以保證椎體后緣骨塊在復(fù)位過程中不被向后擠壓而加重椎管狹窄。入院后在完善檢查期間采用平臥硬床,骨折部位加墊后仰,可以輔助復(fù)位。術(shù)前俯臥過伸位有助于爆裂的椎體后緣骨塊在后縱韌帶的作用下向椎管內(nèi)回復(fù)。術(shù)中發(fā)現(xiàn),通過體位復(fù)位,這類患者大多能明顯減輕后凸成角,使壓縮的椎體復(fù)張。術(shù)中注入高黏度骨水泥,通過膨脹固化,進一步恢復(fù)椎體形態(tài)及高度。術(shù)前肌注布桂嗪(強痛定)能有效減輕術(shù)中疼痛,彌補部分患者局麻止痛效果的不足,使患者能很好配合完成手術(shù)。本組均在局麻下完成,無術(shù)中改用全麻。相比較全麻而言,局麻對心肺功能干擾小很多,安全有效。對于這類患者,術(shù)前要仔細閱讀X線片及CT,了解骨折線走行、椎體破裂部位及程度,設(shè)計手術(shù)進針的方向、角度及深度。術(shù)中穿刺使通道盡量靠近椎體終板完好的一端,保持較大的內(nèi)傾角使穿刺針位于椎體中份,盡量選擇椎弓根完整的一側(cè)穿刺完成手術(shù)。對于穿刺困難、骨水泥彌散不佳的病例,可選擇雙側(cè)椎弓根穿刺。如有較大破損,可先用明膠海綿經(jīng)推桿置入填塞。由于骨折椎體破損多,調(diào)制骨水泥應(yīng)該比單純壓縮性骨折較為黏稠,以降低滲漏率。在推注過程中,先緩慢注入少量骨水泥,待破損邊緣骨水泥硬化形成硬殼保護后,再繼續(xù)推入骨水泥。程喜紅等[5]采用分次灌注法治療椎體后壁破裂的骨質(zhì)疏松性骨折。為保證骨水泥的良好分布,可將水泥推桿先置于椎體前方,根據(jù)術(shù)中影像,椎體前柱彌散滿意后,后退推桿位置,使椎體中柱彌散填充。但不能將推桿退至工作通道后方,否則有引起椎管內(nèi)滲漏的風(fēng)險。本組術(shù)中骨水泥滲漏6例,其中滲漏至椎間盤內(nèi)2例,椎旁3例,椎旁靜脈1例,均無明顯臨床癥狀。這類患者的滲漏率較單純壓縮性骨折高,可能與爆裂性骨折椎體碎裂程度較重有關(guān)。骨水泥是否滲漏并不單純?nèi)Q于骨折類型,還取決于水泥推桿位置以及骨水泥注入時期、速度、量和壓力等多種因素[6]。此外,椎體復(fù)位后可使后縱韌帶緊張,從而阻止后壁骨塊后移,也可以部分阻止骨水泥的滲漏。2例術(shù)后下肢疼痛、麻木,給予靜注甲潑尼龍、甘露醇脫水及甲鈷胺營養(yǎng)神經(jīng)藥物1周后消失,分析可能由于手術(shù)操作中骨塊碎裂刺激神經(jīng)根水腫所致。關(guān)于手術(shù)效果,我們進行了1年左右的隨訪,未發(fā)現(xiàn)嚴(yán)重并發(fā)癥,疼痛緩解及椎體高度恢復(fù)率維持良好。骨質(zhì)疏松是這類患者的基礎(chǔ)病因,PVP手術(shù)只是解決骨折及疼痛問題,術(shù)后仍然需要正規(guī)的抗骨質(zhì)疏松治療,否則容易發(fā)生再骨折及相鄰椎體骨折[7]。任煉等[8]對PVP術(shù)后進行了長達6年的隨訪,各指標(biāo)基本維持穩(wěn)定,結(jié)果證實,椎體成形治療骨質(zhì)疏松性椎體壓縮骨折安全而有效,遠期療效肯定。通過以上分析,我們認為PVP可以用于治療老年骨質(zhì)疏松椎體爆裂性骨折,安全有效,臨床效果良好。但需要操作者具有熟練的穿刺技術(shù),術(shù)前謹慎選擇適應(yīng)證,根據(jù)骨折特點個體化制定手術(shù)方案。參考文獻[1]中華醫(yī)學(xué)會骨質(zhì)疏松和骨礦鹽疾病分會.原發(fā)性骨質(zhì)疏松癥診治指南(2011年).中華骨質(zhì)疏松和骨礦鹽疾病雜志,2011,4(1):2-17.[2] 劉建青,慕明章,杜 偉,等.經(jīng)皮穿刺椎體成形術(shù)綜合治療老年人骨質(zhì)疏松性椎體壓縮骨折20例報告.中國微創(chuàng)外科雜志,2008,8(9):822-824.[3] Li CH,Chang MC,Liu CL,et al.Osteoporotic burst fracture with spinal canal compromise treated with percutaneous vertebroplasty.Clin Neuml Neurosurg,2010,112(8):678-681.[4] 干曼峰,楊惠林,丁 懿,等.椎體后凸成形術(shù)治療骨質(zhì)疏松性椎體爆裂骨折.中國骨與關(guān)節(jié)外科,2012,5(1):11-15.[5] 程喜紅,唐利民,吳 琦,等.分次灌注增強椎體后壁破裂骨質(zhì)疏松性椎體壓縮骨折.中國骨質(zhì)疏松雜志,2010,16(6):444-446.[6] 韓 為,張華山,吳小春,等.后凸成形術(shù)在脊柱爆裂性骨折中的應(yīng)用.實用骨科雜志,2010,16(1):34-24.[7]宋晉剛,苗 艷,崔易坤,等.椎體成形術(shù)后相鄰椎體骨折的臨床研究.臨床合理用藥雜志,2012,5(9):21-23.[8] 任 煉,李志忠,隋 杰,等.骨水泥充填椎體成形治療骨質(zhì)疏松性椎體壓縮骨折:6年隨訪.中國組織工程研究,2012,16(12):2110-2114.(收稿日期:2013-12-09)(修回日期:2014-04-15)(責(zé)任編輯:王惠群)
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