雙腔管單肺通氣用于肺葉切除手術導致肺血流的重建，有可能增加肺水腫的發(fā)生風險。而肺切除術后肺水腫(PPE)是一種致命的并發(fā)癥，發(fā)生于肺切除術后的早期。據(jù)報道PPE的發(fā)生率為2.5～5%，報道中的死亡率都很高【1】。也有學者稱20%的病人有較輕的PPE【2】，文獻報道不太一致。本研究的目的是通過脈搏指示劑連續(xù)心排出量(PiCCO)監(jiān)護儀對肺切除病人術中術后各個階段的肺血管外肺水(EVLW)的監(jiān)測，對比單肺通氣（OLV）和雙肺通氣（TLV）兩種不同通氣方式的變化規(guī)律，分析OLV是否為影響EVLW的重要因素，提供臨床參考。1 資料與方法1.1 病例選擇 采用隨機對照病例研究方法，選擇2010年3月至2010年10月在我院手術的患者作為研究對象。入選標準：術前無心、肝、腎功能障礙，肺功能正?；騼H有輕度通氣功能障礙，未經(jīng)放化療的擇期行肺葉切除術的肺癌患者。排除標準：插雙腔管過程中，因個體差異或者體位問題導致管口定位不良，術中病人OLV時通氣不好，血氧飽和度（SpO2）無法維持在90%以上；手術過早結束，OLV無法達到2小時以上，或者手術過長，OLV時間超過4小時；術中出現(xiàn)緊急情況病人休克或血流動力學不平穩(wěn)，需要加大輸血輸液量的病人。研究經(jīng)過醫(yī)院倫理委員會同意，患者或家屬簽署知情同意書。1.2 分組及麻醉方法 入選病例按隨機原則將術式相同患者分別納入OLV組和TLV組，每組10例，均采用全憑靜脈麻醉。1.2.1 麻醉用藥方案 麻醉誘導：咪唑安定0.1～0.15mg/kg，異丙酚1.5～2.5mg/kg，芬太尼10～20ug/kg，維庫溴銨0.08～0.15mg/kg靜脈推注。麻醉維持：芬太尼1～2g·kg-1·h-1靜注，異丙酚80～100g·kg-1·min-1，瑞芬太尼0.05～0.20g·kg-1·min-1，及維庫溴銨1～2g·kg-1·min-1靜脈微量泵全程維持。術后單次給予氟比洛芬酯50mg靜脈注射后接靜脈自控鎮(zhèn)痛（PCA）泵，鎮(zhèn)痛藥配方：芬太尼2mg＋昂丹司瓊8mg＋氟比洛芬酯100mg，氯化鈉注射液稀釋至100ml，按芬太尼0.4ug·kg-1·h-1的背景劑量連續(xù)靜脈輸注，自控劑量為0.5ml，鎖定時間15min。1.2.2 機械通氣方案 誘導后按不同分組分別插入雙腔或單腔氣管導管。接GE Detex Ohmeda Astiva 麻醉呼吸機維持機械通氣。參數(shù)設置：吸入氧濃度（FiO2）均為100％;TLV組：潮氣量（VT）＝10ml∕kg；呼吸頻率（F）＝16次∕分；吸∕呼比（I∕E）＝1：2；呼氣末正壓（PEEP）＝0 cmH2O；維持氣道壓（Paw）在15～20cmH2O；OLV組： VT＝10ml∕kg；F＝16次∕分；I∕E＝1：2；PEEP＝0cmH2O;維持Paw在30～35cmH2O。根據(jù)實時監(jiān)測的血氧飽和度（SPO2）、呼氣末二氧化碳分壓（PetCO2）及血氣分析進行調(diào)整。術后拔管前接PB840呼吸機，采用容量控制的同步間歇指令通氣（SIMV）模式。參數(shù)設置：FiO2＝40％; VT＝10ml∕kg；F＝14次∕分；I∕E＝1：2；PEEP＝3cmH2O。根據(jù)實時監(jiān)測血氧飽和度（SPO2）及血氣分析進行適當調(diào)整。1.2.3 輸血輸液方案 采用常規(guī)補液方案：輸入液體總量＝補償性擴容＋生理需要量＋累計缺失量＋繼續(xù)損失量＋第三間隙缺失量，晶∕膠比約為2：1；術后：輸入液體總量＝生理需要量＋繼續(xù)損失量。根據(jù)實時監(jiān)測CVP、MAP、CO、及尿量、血氣分析等可進行適當調(diào)整，避免容量過度負荷及使用血管活性藥物。1.3 監(jiān)測與研究方法 除一般資料外，余監(jiān)測指標記錄時限為麻醉開始至術后20小時。1.3.1 患者一般資料 兩組患者入組時的性別、年齡、手術時間、手術方式、急性生理學與慢性健康狀況評分系統(tǒng)Ⅱ（APACHEⅡ）評分。1.3.2 監(jiān)測方法 麻醉誘導前經(jīng)右頸內(nèi)靜脈穿刺放置中心靜脈導管用以注射熱稀釋指示劑及測定CVP和接注射液溫度探頭容納管。股動脈放置動脈熱稀釋導管,檢測熱稀釋曲線。連接支持PiCCO監(jiān)測技術的Philips MP30多功能監(jiān)護儀。校正動脈壓力波形，注射熱指示劑（0～4℃冰生理鹽水8～10ml）觀察其熱稀釋曲線，監(jiān)測并記錄各種血流動力學參數(shù)，包括：中心靜脈壓(CVP)、心排出量（CO）、平均動脈壓(MAP)、系統(tǒng)血管阻力指數(shù)（SVRI）、肺血管外肺水指數(shù)（EVLWI）、全心舒張末期容量指數(shù)（ GEDVI）、胸腔內(nèi)血容量指數(shù)（ITBVI）、肺血管通透性力指數(shù)(PVPI)等。1.3.3 研究方法 EVLW增加常發(fā)生于劇烈的手術操作，手術將近結束和術畢半小時左右。因此，選擇麻醉誘導后各項麻醉有創(chuàng)操作完成，手術開始前，血流動力學穩(wěn)定后首次記錄觀察指標作為術前基礎值（T1），以后分別在各自通氣方式下記錄通氣15min（T2）、30min（T3）、60min（T4）、120min（T5）、150min（T6），術后30min（T7）、1h（T8）、2h（T9）、3h（T10）、5h（T11）、7h（T12）、20h（T13）上述各個血流動力學觀察指標。1.4 統(tǒng)計學處理 所有數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差（`x±s)表示，使用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進行分析，兩組間同一指標的差別分析采用重復測量的方差分析；EVLWI與其他指標的相關性采用多元線性相關與回歸分析；P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。2 結果2.1 兩組一般資料比較（表1）：將每兩例手術部位相同的行肺葉切除術的肺癌患者隨機分入OLV和TLV組。兩組性別、年齡、手術時間、手術方式、急性生理學與慢性健康狀況評分系統(tǒng)Ⅱ（APACHEⅡ）評分比較差異均無統(tǒng)計學意義（P﹥0.05）。表1 兩組患者一般資料比較組別例數(shù)性別年齡手術時間（h）APACHEⅡ評分（`x±s，分）男女（`x±s，歲）TLV組108254.70±6.702.11±0.146.80±1.32OLV組108252.70±12.702.09±0.147.00±1.632.2 術中、術后監(jiān)測的一般血流動力學變化﹙表2﹚ CO,CVP,MAP，SVRI兩組間差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。但是隨時間的變化，各指標表現(xiàn)出一定變化趨勢(P＜0.05)。CO在手術前﹙T4﹚增加，手術中保持平穩(wěn)，手術后兩小時內(nèi)即拔管前﹙T8、T9﹚增加明顯，拔管后穩(wěn)定但保持在較高的心排出量水平﹙T10～13﹚﹙圖1﹚。CVP手術結束前﹙T6﹚呈小幅增加后維持在一定水平但在術后兩小時內(nèi)有倒“V”型變化﹙T7～9﹚﹙圖2﹚。MAP在開胸前平穩(wěn)，開胸后增加﹙T5﹚，至關胸前達最大﹙T7﹚，關胸后略下降﹙T8﹚，以后維持在比術前較高的水平﹙圖3﹚。SVRI在開胸前明顯減低﹙T4﹚，開胸后顯著增加﹙T5﹚，關胸后迅速回落﹙T7﹚，恢復至術前水平﹙圖4﹚。表2 一般血流動力學指標的變化指標分組T1T2T3T4T5T6T7T8T9T10T11T12T13CO（ml/min）TLV4.80±2.095.06±2.116.44±3.236.44±3.255.88±2.565.54±2.255.97±1.98＊6.74±2.99＊6.85±2.32＊＊6.56±2.41＊＊6.69±2.64＊6.70±2.05＊＊6.18±2.30＊OLV5.12±1.395.53±1.146.01±1.645.83±1.38＊5.79±1.665.58±1.847.15±2.17＊＊7.50±2.36＊＊6.73±2.00＊6.77±1.98＊6.12±2.016.90±2.14＊＊6.82±1.34＊＊CVP（mmHg）TLV7.1±1.57.6±2.68.4±2.38.7±2.3＊9.1±2.3＊9.4±2.4＊11.8±2.1＊＊12.6±2.1＊＊10.8±2.4＊＊9.9±2.2＊＊9.6±3.1＊9.6±2.7＊10.3±2.1＊＊OLV7.0±2.17.8±1.98.2±2.28.3±2.28.5±2.18.7±3.111.8±3.8＊＊9.8±2.6＊＊8.6±2.38.5±3.08.0±1.98.3±1.77.5±2.4MAP（mmHg）TLV88±1084±1187±1088±1597±11＊97±10110±16＊＊108±12＊＊103±11＊＊101±12＊＊100±9＊＊101±6＊＊95±11OLV88±1484±1485±886±1490±1996±13110±14＊＊107±17＊94±994±1093±1492±1494±10SVRI（DSM2/cm5）TLV2768±14652449±11641986±9181871±719＊2273±9282472±11162304±8622246±8832014±7192127±8082003±5461996±5632031±680＊OLV2359±8861973±4881918±5691956±6832101±6402337±8232088±8042031±9261920±6501893±6802077±10431855±7081814±583與T1相比：＊，P＜0.05 ＊＊，P＜0.012.3 PiCCO監(jiān)測技術觀察到的特殊血流動力學變化﹙表3﹚EVLWI,GEDVI,ITBVI,PVPI兩組間差異亦無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。EVLWI與PVPI的變化趨勢相同，均隨時間的延長而下降，從時間點上看術后20小時﹙T13﹚與術前﹙T1﹚相比已有明顯的差異（P＝0.000）﹙圖6、7﹚。GEDVI與ITBVI組間差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）,在手術結束后一小時內(nèi)有一個短暫的增加。2.4 EVLWI與其他指標的相關性術中回歸方程EVLWI＝－4.344＋0.008GEDVI＋3.989PVPI,可見術中EVLWI與GEDVIa、PVPIb呈正相關（r a＝0.504；r（a，b）＝0.747）;術后回歸方程EVLWI＝－2.519＋3.984PVPI＋0.006GEDVI＋0.000SVRI,可見術后EVLWI與PVPIa、GEDVIb、SVRIc呈正相關（r a＝0.583；r（a，b）＝0.898;r(a＋b＋c) ＝0.904）;總的回歸方程EVLWI＝－3.515＋4.045PVPI＋0.007GEDVI－0.065CVP,可見EVLWI與PVPIa、GEDVIb呈正相關，與CVPc呈負相關（ra＝0.512；r（a，b）＝0.858;r(a＋b＋c) ＝0.861）。EVLWI與CO、CVP、MAP、ITBVI均無相關（P＞0.05）。3 討論OLV常用于肺癌根治性切除手術。這類手術技術難度大，需要進行縱隔淋巴結清掃，要求安靜合適的手術視野和操作區(qū)域。許多外科醫(yī)師習慣在肺塌陷下操作，可以減少牽拉，提高肺解剖清晰度，縮短手術時間。同時，OLV可以進行兩肺分隔通氣，防治操作時手術側(cè)的分泌物流入健側(cè)支氣管，有很好的肺保護作用。但是，OLV期間由于一側(cè)肺萎陷，很易發(fā)生缺氧或低氧血癥，長時間的肺萎陷或多次重復萎陷與復張，可損傷毛細血管內(nèi)皮細胞。氣道壓增加、雙腔管形態(tài)學原因，可出現(xiàn)氣管粘膜損傷。另外，麻醉過程中純氧機械通氣，有報道【3】其也是術后肺不張低氧血癥的原因之一。且OLV過程中，雙肺血流大部分流向通氣側(cè)肺，肺動脈壓力升高，致V/Q失調(diào)的同時也可能導致肺泡-毛細血管應力衰竭【4】。因此，OLV的安全性備受關注。EVLW作為肺水腫的早期診斷指標越來越受到人們的重視，而PiCCO技術則使EVLW的監(jiān)測成為可能，它能敏感的探測EVLW的微小改變(10%一20%)【5】。PiCCO是經(jīng)肺熱稀釋法與脈搏輪廓曲線分析技術相結合的監(jiān)測方法。采用成熟的熱稀釋法測量單次心排血量(CO)，并通過分析脈搏輪廓曲線下面積與CO存在的一定關系，獲取連續(xù)心排出量(PCCO)及一系列容量參數(shù)： EVLW、GEDV、ITBV、PVPI等。然而肺切除術后肺血流量及肺容積均發(fā)生了改變，我們有理由懷疑該法的可靠性。有研究【6】證實：PiCCO與肺稱重法有密切的相關性（r＝0.96，P＜0.0001）。即便是單肺切除術后，二者仍然有較好的相關性（r＝0.90，P＜0.0001）。OLV由于醫(yī)源性的一側(cè)肺萎陷，導致肺循環(huán)的重新分布，有可能導致血管外肺水的改變而增加術后肺水腫的風險。因此，本文通過PiCCO對擇期肺癌根治術病人術中和術后20h各項血流動力指標的監(jiān)測，希望能盡早發(fā)現(xiàn)EVLW增多的證據(jù)和可能的影響因素，指導OLV麻醉的實施和管理。本研究結果顯示：OLV組與TLV組間各項一般血流動力學指標均無顯著差異。從時間點上看，CO受應激影響較大，手術前進行麻醉插管與手術后蘇醒拔管及拔管后手術部位疼痛等傷害性刺激時均使心排量增加。CVP手術結束前呈小幅增加后維持在一定水平但在術后兩小時內(nèi)有倒“V”型變化?？紤]與手術操作過程中術者擠壓縱隔、心臟及麻醉機與呼吸機的使用造成胸腔內(nèi)壓力增加有關。在機械通氣的情況下，胸腔內(nèi)壓力的增加一方面可以引起CVP增高，另一方面使靜脈回流受阻和右室充盈受限【7】。開胸后肺部生理改變及術中使用麻醉藥物致心肌順應性低的情況下，較少的容量也會引起CVP的明顯增加。此再次證明CVP反映心臟前負荷及循環(huán)血容量的局限性【8】。MAP與SVRI均代表心臟后負荷，二者結果符合開胸肺生理變化，無特異性表現(xiàn)。對PiCCO監(jiān)測的特殊血流動力學指標的監(jiān)測結果顯示：OLV組與TLV組間各項特殊血流動力學指標同樣無明顯差異。EVLWI與PVPI的變化趨勢相同，均隨時間的延長而下降，從時間點上看術后20小時與術前相比已有明顯的差異（P＝0.000）。但在術后兩小時前，EVLWI均保持在增多的水平，然而并未達到肺水腫提示，EVLWI正常值為3.0～7.0 ml/kg,大于2倍則提示有肺水腫【9】。EVLWI增多的可能原因為：（1）肺泡上皮細胞在不同程度的氧化應激反應下可以發(fā)生凋亡和壞死，使肺血管屏障遭到破壞，肺血管通透性增加；（2）壓力和氧合水平的改變也可能會導致肺泡壁的損傷，并進一步造成液體和蛋白質(zhì)進入肺泡腔；（3）缺氧或低氧血癥加重肺間質(zhì)的損傷；（4）雖然有炎癥因子大量釋放，但肺毛細血管上皮細胞受損不足以引起肺血管通透性大幅改變，這可能與機體抗損傷機制和麻醉藥物的器官保護作用有關。從過去的研究得知PPE的病生改變與ARDS基本相同，內(nèi)皮細胞屏障損害是其始動因素。因此監(jiān)測PVPI對于評價內(nèi)皮細胞損害具有重要意義。本研究中雖然PVPI術中比術后高，但均在正常范圍內(nèi)（PVPI＝EVLW/PBV，正常值是1～3，PBV為肺血容量）。國內(nèi)有研究也得出了相同結論【10】。在開胸手術中，由于麻醉藥的血管擴張作用、機械通氣以及缺氧性肺血管收縮等作用可能造成PBV的減少。因此PVPI能否準確的反映開胸手術中肺血管內(nèi)皮通透性的改變以及可能的影響因素都需要進一步的研究。GEDVI與ITBVI無論是組內(nèi)時間還是組間差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。由于ITBV和GEDV包括左右心房、心室舒張末期的容積，且不受一般手術操作及麻醉、復蘇影響，因此能更好的反映心臟的充盈狀態(tài)，此再次證明它是體現(xiàn)心臟前負荷的優(yōu)秀指標【11】。本研究結果還表示， EVLWI與PVPIa、GEDVIb明顯正相關（r（a，b）＝0.806，P＝0.000），雖然統(tǒng)計學上與SVRI（r＝0.006，P＝0.000）、CVP(r＝0.003，P＝0.000)呈相關關系，但是決定系數(shù)（r2）過小，聯(lián)系臨床實際沒有意義，因此EVLWI與CO、CVP、MAP、SVRI、ITBVI均無相關（P＞0.05）。國內(nèi)有研究也得出了相同結論【12】。此相關分析除了印證上述結果外，也提示在麻醉與復蘇過程中液體治療不宜過多，與國內(nèi)外研究結果同【13】。綜上所述，OLV組病人圍術期及術后的血流動力學和EVLW沒有發(fā)生明顯的變化，OLV對肺癌肺葉切除患者EVLW影響輕微，是一項安全的麻醉操作。在開胸手術中由于胸腔內(nèi)壓力的變化，用CVP反映機體的前負荷狀態(tài)存在一定的誤差，而GEDI和ITBI不受胸腔內(nèi)壓力變化的影響能很好的反映機體的容量狀態(tài)。雖然由于OLV的病理生理改變可能造成一定的缺血、缺氧性損傷，但在機體抗損傷機制的作用下，不會造成特異性的肺損傷，引起EVLW增多。EVLW的增多主要與血管通透性增加及循環(huán)血容量增加有關，提示術中在保持血流動力學穩(wěn)定的同時，應注意防止容量過度超負荷。參考文獻1 Turnage WS,Lunn JJ.Postpneumonectomy pulmonary edema:A retrospectine analysis of associated variables.Chest.1993;103:1646.2 Waller DA,Keavey P,Woofine L,et al.Pulmonary endothelial permeability changes after major lung resection.Ann Thorac Surg.1996;61:1435.3 Hedenstierna G. 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單肺通氣（OLV）是胸科手術一種特殊的機械通氣模式，然而它在使兩側(cè)肺分別通氣，為手術提供便利條件的同時也不可避免地會產(chǎn)生一些不良反應。在臨床麻醉工作中，OLV引起的肺損傷越來越受到重視，但OLV所致肺損傷的發(fā)病機制尚未闡明。近年來，細胞凋亡在肺組織損傷中起著重要的的作用，有研究認為在機械通氣的早期就有肺泡上皮細胞凋亡的發(fā)生[1]，而對OLV過程中肺組織細胞凋亡的研究少見報道。本實驗旨在研究OLV時肺組織細胞凋亡指數(shù)及凋亡執(zhí)行因子Caspase-3的表達，分析其變化與OLV所致肺損傷的關系。材 料 與 方 法動物分組 健康SD雄性大鼠42只，體重200～250g(由廣西醫(yī)科大學實驗動物中心提供)。分成空白對照組(C組)，雙肺通氣對照組(B組), 單肺通氣組(A組)。C組為自主呼吸組，A組和B組分別分成三個亞組：A1組（OLV 0.5h，恢復通氣0.5h），A2組（OLV 1h，恢復通氣0.5h），A3組（OLV 1.5h，恢復通氣0.5h）和B1組（雙肺通氣1h）,B2組（雙肺通氣1.5h）,B3組（雙肺通氣2h）。大鼠隨機分配，每組6只，共七組。 模型制備 A組大鼠予氯胺酮80mg/kg，速眠新Ⅱ0.6～0.8ml/kg肌肉注射實行麻醉，行氣管切開并插入自制氣管導管至主氣管，給予維庫溴銨2mg/kg，待呼吸漸微弱，接呼吸機(江灣Ⅰ型微型動物呼吸機)進行機械通氣，通氣參數(shù)為：氧濃度(FiO2):100％，潮氣量（VT）:10ml/kg,呼吸頻率（RR）:60次/min，于左側(cè)第五肋間開胸，暴露左肺，將氣管導管過深插入至右側(cè)支氣管，調(diào)節(jié)通氣參數(shù)VT：5-6ml/kg,RR：80次/分，見左側(cè)肺葉萎陷，對側(cè)肺通氣，開始計時，至預定時間將氣管導管退回主氣管開始復張，恢復至雙肺通氣時的通氣參數(shù)。B組則于暴露左肺后，始終保持雙肺通氣至預定時間。標本采集 C組大鼠麻醉后迅速頸動脈放血處死，A組和B組通氣至預定時間后立即頸動脈放血處死動物，分離兩側(cè)完整肺葉，置入預冷的生理鹽水中，漂洗數(shù)次，以清潔表面的血跡，用濾紙吸干，分別取部分左肺下葉組織置入4%多聚甲醛固定48h，脫水后石蠟包埋，做肺組織切片。取余下左肺下葉組織，-80℃超低溫冰箱保存待檢。檢測項目與方法 HE染色光鏡下觀察肺組織形態(tài)結構的改變；免疫印跡法檢測肺組織中Caspase-3蛋白的表達，Image Lab凝膠圖像分析系統(tǒng)對膠片掃描后的Western blot反應蛋白條帶圖像進行分析，得出目標帶的灰度值，計算出各組目標蛋白條帶的灰度值和內(nèi)參GAPDH蛋白條帶的灰度值的比值；原位末端標記法(TUNEL)染色檢測肺組織的細胞凋亡指數(shù) (每張切片選取10個不重復視野，細胞核呈棕黃色染色為陽性細胞，計算每高倍視野中陽性細胞數(shù)和該高倍視野中細胞總數(shù)的比值)，計算平均值。統(tǒng)計學分析 經(jīng)SPSS13.0軟件包進行統(tǒng)計學分析,計量資料以均數(shù)±標準差(x(_)±s)表示。各亞組間比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，組間兩兩比較采用 LSD-t檢驗。相對應亞組間樣本比較采用t檢驗； P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。結 果HE染色 C組肺組織無明顯病理改變，肺泡結構形態(tài)完整，肺泡間隔正常；B組中B1組無明顯病理改變，隨通氣時間增加B2，B3組肺泡內(nèi)可見少量滲出液，肺間質(zhì)增厚；A組中A1組可見少量滲出液，肺間質(zhì)增厚；A2組、A3組非通氣側(cè)肺泡內(nèi)可見大量紅細胞，部分肺泡腔萎陷不張，肺間質(zhì)增厚明顯。TUNEL染色 C組肺組織內(nèi)未見明顯凋亡細胞；B組在雙肺通氣2h肺組織內(nèi)可見少量凋亡細胞。A組內(nèi)各亞組隨著通氣時間的延長，A1組內(nèi)未見明顯凋亡細胞， A2組肺泡腔內(nèi)側(cè)面可見少量陽性細胞，其細胞凋亡指數(shù)較B2組明顯增加（P＜0.05），A3組肺泡腔內(nèi)側(cè)面和肺間質(zhì)的陽性細胞明顯增多，其細胞凋亡指數(shù)與B3組比較明顯增加（P＜0.05）肺組織Caspase-3蛋白含量 與C組比較，A1組Caspase-3蛋白含量沒有明顯變化（P＞0.05），A2組和A3組表達增加（P＜0.05），且隨著通氣時間的延長，C組=A1組＜A2組＜A3組（P＜0.05）；與B組各亞組比較，A1組和B1組差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），A2、A3組均較與之相對應的B2、B3組表達增加（P＜0.05）。表1 各組大鼠肺組織細胞凋亡指數(shù)和Caspase-3蛋白表達的比較（n=6,`x±s）檢測指標C組A1組A2組A3組B1組B2組B3組AI(％)0.12±0.080.13±0.086.17±0.75 ab16.00±1.10 ab0.15±0.100.18±0.084.83±0.75 aCaspase-30.21±0.020.22±0.020.34±0.01ab0.69±0.01ab0.22±0.010.23±0.010.28±0.01a與C組比較，aP＜0.05；與B組對應亞組肺相比較bP＜O.05；討 論OLV作為一種特殊的機械通氣現(xiàn)已廣泛應用于胸外科手術中，但OLV期間由于非通氣側(cè)肺的血液沒有得到充分的氧合而造成靜脈血摻雜，從而引起肺組織缺氧，并導致肺組織細胞損傷以及功能的損害，此外，肺萎陷后復張及在復張通氣過程中過度的牽張等都可引起一系列反應，可加重并且引起肺損傷[2]，甚至可引起VILI。實驗結果發(fā)現(xiàn)，隨著OLV時間的延長，大鼠肺組織逐漸表現(xiàn)出肺泡結構的破壞并出現(xiàn)充血水腫，肺間質(zhì)逐漸增厚等變化,與前期研究結果一致[3]。OLV引起肺部損傷涉及機械傷、生物傷等多種復雜的損傷機制。近年來的許多研究認為，各種因素通過誘導肺組織細胞的過度凋亡導致肺泡結構破壞，加重肺泡毛細血管膜的損傷而參與急性肺損傷的過程[4]。在機械通氣的研究中，主要認為支氣管上皮細胞和肺泡上皮細胞由于機械牽拉的刺激，通過激活NF-κB的炎癥級聯(lián)反應，促進細胞的凋亡[1]。本實驗中雙肺通氣對照組在通氣2h時肺組織中可見有少量凋亡細胞；而在OLV組中，隨著OLV時間的延長，在OLV1h復張0.5h時大鼠肺泡腔內(nèi)側(cè)面即可見少量凋亡細胞，OLV1.5h后復張0.5h時大鼠肺泡腔內(nèi)側(cè)面及肺間質(zhì)中發(fā)現(xiàn)有較多凋亡的細胞，這些變化比在相同時間雙肺通氣組大鼠肺組織中表現(xiàn)更為明顯。造成此種情況的原因可能與OLV經(jīng)歷了萎陷后復張通氣復雜的病理生理過程相關，而這種復雜的過程可能比單純的機械牽拉對肺組織細胞凋亡的影響更大。Krick及其同事[5]研究發(fā)現(xiàn)在低氧的狀態(tài)下大鼠通過誘導低氧誘導因子 (HIF-1)可引起肺泡Ⅱ型上皮細胞凋亡。在OLV過程中，非通氣側(cè)肺萎陷，肺泡氧分壓下降，使得非通氣測肺組織缺氧，可導致肺組織細胞的凋亡。而這種肺泡氧分壓下降后可引起肺血管阻力增加即非通氣側(cè)肺缺氧性肺血管收縮(HPV)，是肺循環(huán)對缺氧的一種代償反應，但是HPV在起到這些保護作用的同時，也減少了肺組織的血流灌注量。OLV時肺組織的低血流灌注及缺氧可激活肺組織中PMN, 激活的PMN耗氧量大增,不但進一步增加組織的缺氧,而且還釋放大量的細胞因子和炎癥介質(zhì)。OLV組大鼠在OLV至預定時間后，均恢復通氣0.5h,當恢復通氣后，肺組織氧供的快速恢復也可激活肺組織中PMN并激活氧化應激反應，可使血液和肺組織中氧自由基、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）和白細胞介素-lβ（LI-lβ）等炎性介質(zhì)增加[6]。游志堅等[7]的研究結果也表明兔OLV時肺組織氧化應激水平顯著升高，并且隨著OLV時間的延長，這種趨勢表現(xiàn)的更為明顯。然而大量的氧自由基、TNF-α和LI-lβ等炎性因子均可導致肺泡上皮細胞及血管內(nèi)皮細胞凋亡的增加，并導致肺血管內(nèi)皮屏功能的障礙 [8]。An S等[9]認為小腸缺血再灌注后通過上調(diào)TNF-α導致Ⅱ型上皮細胞凋亡從而引起肺組織損傷。在非通氣側(cè)肺萎陷后復張的過程中,肺泡的膨脹并非都是協(xié)調(diào)的,膨脹和萎陷肺泡交界處產(chǎn)生的界面切力對肺泡壁過度牽張可引起肺泡上皮細胞的凋亡[10]。本實驗中隨著OLV時間的延長肺組織凋亡細胞增多，可導致肺泡結構破壞和肺組織病理變化加重，這與本實驗中光鏡下觀察到的肺組織病理改變相一致。Caspase-3是Caspase家族中最重要的凋亡效應因子，在凋亡的執(zhí)行階段，它負責對全部或部分關鍵性蛋白酶的裂解，從而使DNA片斷化，導致細胞凋亡。因此大鼠肺組織Caspase-3蛋白表達的變化也可直接反應肺組織中細胞凋亡的情況。為了進一步了解OLV引起細胞凋亡的機制和作用途徑，我們用免疫印跡法研究Caspase-3蛋白表達量的改變。從實驗結果看，Caspase-3蛋白表達的變化和TUNEL檢測的細胞凋亡變化的趨勢大體一致，因而也證實了TUNEL法檢測的結果。綜上所述，隨著通氣時間的延長，OLV可導致肺組織結構的改變，并導致細胞凋亡及其凋亡執(zhí)行因子Caspase-3蛋白表達增加，由此推測細胞凋亡可能是OLV導致肺損傷的重要因素。但關于更具體的作用機理，還有待于進一步研究。參 考 文 獻[1] 趙兵，張華茹，李海明等.大鼠機械通氣相關性肺損傷與肺組織細胞凋亡的關系[J].中國實用醫(yī)刊,2011,38(3):50-52.[2] Plataki M, Hubmayr RD. 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水通道蛋白在體內(nèi)廣泛分布，具有特殊的分子結構和生物學特性，屬膜主體內(nèi)在蛋白(Major Intrinsic Protein, MIP)家族成員,具有增加細胞膜水通透力的功能,可以提供快速液體轉(zhuǎn)運的途徑。其中，AQP-5主要表達在Ⅰ型上皮細胞的頂膜，其主要功能是參與水轉(zhuǎn)運及腺體分泌，與氣道高反應性有關[1]。單肺通氣技術(one-lung ventilation，OLV)廣泛應用于胸科手術中，可以為術者創(chuàng)造良好的操作條件，減少肺部并發(fā)癥，避免手術側(cè)肺的分泌物或滲出物流入健側(cè)通氣肺，但OLV過程中常引起肺內(nèi)分流增加導致低氧血癥等改變，肺水腫也是其嚴重并發(fā)癥之一。因此，研究單肺通氣與AQP-5的關系具有一定的臨床參考意義。近來，有人主張左主支氣管結扎法和氣管插管過深法建立兔OLV模型[2, 3]。因大鼠支氣管與血管結合緊密且脆弱易破極難將兩者分離，我們分別采用左側(cè)主支氣管連同血管一并夾閉[4]和氣管過深插管建立兩種大鼠單肺通氣模型，通過免疫印跡法定量檢測各組大鼠AQP-5表達的變化，研究AQP-5在OLV過程中與急性肺損傷（Acute Lung Injury，ALI）的關系，探討缺血再灌注損傷在AQP-5表達變化中所起的作用。1.材料和方法1.1 實驗動物和分組：SD大鼠60只，廣西醫(yī)科大學實驗動物中心提供，雄性，體重200～250g。分為夾閉左側(cè)肺門OLV組（A組），過深插管OLV組（B組），雙肺通氣對照（C組），空白對照組（D組）。A、B、C組分別按不同通氣時間再分三個亞組，A1組：OLV0.5h，復張0.5h，總通氣時間1.0h；A2組：OLV1.0h，復張0.5h，總通氣時間1.5h；A3組： OLV1.5h，復張0.5h，總通氣時間2.0h；B1：OLV0.5h，復張0.5h，總通氣時間1.0h；B2組： OLV1.0h，復張0.5h，總通氣時間1.5h；B3組：OLV1.5h，復張0.5h，總通氣時間2.0h；C1：雙肺通氣1.0h；C2：雙肺通氣1.5h； C3：雙肺通氣2.0h。用excel隨機函數(shù)表隨機分配，各亞組和空白對照組每組6只。1.2主要試劑： AQP-5兔抗鼠多克隆抗體購自Abcam公司（1:10000稀釋），羊抗兔二抗和GAPDH內(nèi)參抗體購自Santa Cruz公司（1:500稀釋），PVDF 膜購自大連寶生物有限公司。1.3實驗模型的建立 1.3.1 實驗動物的麻醉和監(jiān)護 實驗大鼠予肌注氯胺酮80mg/kg，速眠新2（第二軍醫(yī)大學研制）0.6～0.8ml/kg[5]，取仰臥位，予頸部及左側(cè)胸部備皮，固定四肢。待大鼠進入完全麻醉狀態(tài)，沿頸部正中縱向切開，暴露氣管，于第一環(huán)狀軟骨下緣氣管切開，置入氣管導管（自制)約2cm，給予維庫溴銨2mg/kg，待呼吸漸微弱至停止（約5分鐘）接呼吸機（江灣Ⅰ型微型動物呼吸機），VT10ml/kg，RR60次/min，純氧接入。除空白組外所有大鼠均于麻醉誘導后行頸動脈穿刺置管監(jiān)測心率和有創(chuàng)血壓，體表血氧探頭檢測血氧飽和度。血壓能夠較平穩(wěn)地維持于80/60mmHg～140/110mmHg（1mmHg=0.133kPa）之間，血氧飽和度維持在90%～100%，心率約200～400次/min。1.3.2實驗動物模型的制作 輕柔操作，將大鼠置于右側(cè)臥位。于左側(cè)胸第五肋間開胸，去除第五肋部分肋骨，暴露肺葉。A1、A2、A3組將左側(cè)肺門部以套膠皮管的微型血管鉗夾閉，立即調(diào)節(jié)VT至5ml/kg,RR80次/min，見左側(cè)肺葉不張，可良好地觀察到右肺3、4葉，開始計時，復張時除去血管鉗，調(diào)節(jié)VT至10ml/kg,RR60次/min[4]，約5min～10min后肺復張良好。B1、B2、B3組于暴露肺葉后將氣管導管推進至3.0cm～4.0cm處，使導管進入右側(cè)支氣管，調(diào)節(jié)VT為5ml/kg,RR80次/min，見左側(cè)肺葉不張，可良好地觀察到右肺3、4葉，開始計時，復張時將氣管導管退回至2cm處，調(diào)節(jié)VT10ml/kg，RR60次/min，約5min后肺復張較好。C1、C2、C3組于暴露肺葉后，可見肺膨脹良好，開始計算時間。其OLV過程有時有少量漏氣，可觀察到非通氣側(cè)肺有點狀通氣，如漏氣較嚴重時需要對導管稍作調(diào)整。1.3.3 實驗動物的標本采集和保存 空白組予相同方法麻醉后迅速處死，其余各組達到預定通氣時間后立即處死，因需比較相同部位及兩側(cè)對應部位的肺組織，分別取部分左肺下葉和部分右肺第3、4葉肺組織，4%多聚甲醛固定48h，脫水后石蠟包埋。取余下左肺下葉和右肺第3、4葉肺組織置于液氮罐中迅速冷凍，并轉(zhuǎn)移至﹣80℃低溫冰箱保存。1.4蠟塊5μm厚切片，HE染色光鏡觀察。1.5免疫印跡分析AQP-5表達的變化 低溫下取肺組織（50±5）mg，剪碎加入預冷的6倍體積的RIPA裂解液和1:300的蛋白酶抑制劑，勻漿后10000r/min離心5min，取上清液。用BCA標準曲線法測定蛋白濃度，樣品1:4體積加入×SDS2PAGE上樣緩沖液，70℃水浴10分鐘，GAPDH為內(nèi)參，SDS-PAGE凝膠電泳，轉(zhuǎn)PVDF膜，一抗（1:10000）孵育，4℃過夜，洗膜，加入二抗（1:500），常溫孵育一小時，洗膜后暗室曝光，膠片顯影，用QUANTITY ONE圖像分析系統(tǒng)對掃描后的蛋白條帶圖像進行分析，數(shù)值越大，表示灰度值越大。1.6 統(tǒng)計學處理 以AQP-5目的蛋白條帶的灰度值和內(nèi)參GAPDH蛋白條帶的灰度值的比值做統(tǒng)計學分析。應用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學處理，計量資料均以`x±s表示，各組數(shù)據(jù)服從正態(tài)分布并滿足方差齊性要求，比較A、B、C組組內(nèi)各亞組及D組有無差異、相同時點各亞組有無差異采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，各亞組左右兩側(cè)比較、各亞組及空白對照組組間兩兩比較采用 LSD-t檢驗，檢驗水準ɑ=0.05, P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。2.結果2.1 肺組織大體觀察 ①D組大鼠肺組織，肺組織呈現(xiàn)萎陷狀態(tài)，淺紅色，質(zhì)均勻。② C組肺組織大體呈粉紅色，質(zhì)均勻。③A組，非通氣側(cè)復張較好，復張過程中有少部分肺組織復張不良，呈點狀或小塊狀暗紅色，復張良好肺組織呈粉紅色，通氣側(cè)肺組織均勻呈粉色。④B組大體與夾閉一側(cè)肺OLV相近。各實驗組及雙肺通氣組肺組織隨通氣時間的增加有腫脹趨勢，但外觀無明顯肺水腫。2.2 光鏡觀察 ①D組大鼠肺泡腔清晰，肺泡大小均勻，間隔纖細，毛細血管內(nèi)可見血細胞。②C組可見肺組織肺泡間隔增寬，隨通氣時間增加，肺間隔增寬明顯，部分肺泡腔內(nèi)出現(xiàn)少量紅細胞，通氣時間2.0h各亞組可見毛細血管擴張充血，部分肺泡壁破裂，肺泡腔融合，腔內(nèi)可見紅細胞，呈肺水腫表現(xiàn)，左右兩側(cè)變化一致。③A組的變化與C組相近，通氣側(cè)肺組織變化較非通氣側(cè)輕，主要表現(xiàn)在非通氣側(cè)肺泡腔內(nèi)紅細胞數(shù)量較多。④B組的變化與C組相近，通氣側(cè)與非通氣側(cè)變化差別不大。2.3 Western blot結果顯示：結果如表1及圖1、圖2所示。D組肺組織AQP-5呈較高水平的陽性表達，均高于A、B、C組內(nèi)各亞組（P＜0.05）。各亞組左右兩側(cè)肺AQP-5的表達無統(tǒng)計學差異（P＞0.05）。A、B、C組組內(nèi)各亞組比較差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）, A1、B1、C1組間比較差異均無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)；A2、B2、C2組間比較，A2組較B2組和C2組AQP-5的表達減少（P＜0.05），B2組和C2組無統(tǒng)計學差異（P＞0.05）；A3、B3、C3組間比較，A3組、B3組均表現(xiàn)出與C3的區(qū)別（P＜0.05），且A3組比B3組AQP-5的表達減少（P＜0.05）。表1免疫印跡法定量檢測肺組織AQP-5蛋白的表達（n=6,`x±s）1.0h1.5h2.0h A組1.88±0.07cd0.97±0.07abd0.53±0.11abB組1.82±0.07cd1.43±0.11d0.77±0.07bC組1.71±0.22cd1.41±0.23d 1.02±0.05與B組比較aP＜0.05；與C組比較bP＜0.05; 與1.5h組相比cP＜0.05；3.討論AQP-5是肺組織液體快速轉(zhuǎn)運的通道,對維持肺組織的正常生理功能起著重要作用。急性肺損傷（ALI）是指機體遭受嚴重感染、創(chuàng)傷、輻射、休克等打擊后, 出現(xiàn)的以彌漫性肺泡上皮細胞和肺泡毛細血管內(nèi)皮細胞膜損傷為病理特點的綜合征。胸科手術中存在手術損傷、機械通氣性損傷、氧化應激反應、液體超載，麻醉藥物、細胞因子等致ALI病因。有研究表明，促進AQP-1和AQP-5的表達，可以加快肺水的運輸和清除，提高水的平衡，消除肺水腫，從而有效地防治急性肺損傷[6]。李波等研究得出的結論認為AQP-1和AQP-5可能參與ALI液體的異常轉(zhuǎn)運，與肺水腫的發(fā)病機制有關[7]。我們從實驗大鼠的肺組織病理切片觀察到，隨通氣時間的延長，肺組織出現(xiàn)了肺水腫征象，這與通氣過程中的ALI關系密切，提高AQP-5的含量或者活性，可能有利于消除肺水腫，對防治ALI有積極的意義。OLV可使肺內(nèi)分流增加，這時產(chǎn)生缺氧性肺血管收縮（hypoxic pulmonary vasoconstriction，HPV）是機體維持通氣和血流比相適應的代償性保護機制。本實驗中A組單肺通氣時阻斷了一側(cè)肺的血流，這時單肺通氣過程并沒有增加肺內(nèi)分流，理論上此時該側(cè)肺不需要HPV代償機制，阻塞解除后，萎陷的肺達到良好復張的一段時間內(nèi)同時存在HPV代償機制和缺血再灌注損傷機制。B組在行單肺通氣時即可發(fā)生HPV,減少肺通氣側(cè)血流，調(diào)節(jié)通氣/血流比，萎陷的肺達到良好復張的一段時間內(nèi)僅存在HPV代償機制，無缺血再灌注損傷機制。有人在實驗中觀察到再灌注后肺組織超氧化物歧化酶（SOD）含量進行性下降，并認為肺缺血再灌注損傷可能與肺內(nèi)細胞因子釋放增加,中性粒細胞聚集、激活、氧自由基產(chǎn)生和清除失衡有密切關系[8]。此外，缺血時間的長短，與再灌注損傷的發(fā)生與否有關[9]。OLV時肺非通氣側(cè)由于阻塞導致缺血或HPV導致低灌注，肺隨阻塞去除而復張同時伴隨肺組織的再灌注可導致氧自由基的產(chǎn)生[10]，通氣側(cè)則可能同時受到高氧、容量傷和低灌注導致的的復合損傷。我們的實驗結果顯示各亞組左右兩側(cè)肺AQP-5的表達變化是一致的，即夾閉側(cè)與對側(cè)的變化程度相當，由此可見AQP-5的調(diào)節(jié)在此體現(xiàn)于全肺組織。實驗組和雙肺通氣對照組與空白對照組相比AQP-5蛋白表達下降，表現(xiàn)出與機械通氣時間相關，單肺通氣較雙肺通氣AQP-5表達下降，且夾閉方式比過深插管方式更早出現(xiàn)AQP-5的下降，在此缺血再灌注損傷機制可能對AQP-5的下調(diào)起到了一定的促進作用。OLV時AQP-5的表達比雙肺通氣減少，也可能與機械牽張及復張性肺水腫有關。機械正壓通氣，萎陷和復張過程，開胸手術操作對肺組織的牽拉等機械牽張過程，及通過誘導炎性介質(zhì)表達和釋放，可引起呼吸機所致肺損傷（ventilator-induced lung injury ，VILI）[11]。復張性肺水腫（reexpansion pulmonary edema，RPE）是繼發(fā)于各種原因所致的肺不張在肺迅速復張時（或之后）所發(fā)生的急性肺水腫。復張性肺水腫的發(fā)生機制較為復雜，與下列因素有關: ①復張時毛細血管機械損傷,使毛細血管內(nèi)皮細胞間隙增寬，同時由于肺膨肺時毛細血管內(nèi)壓增加，可促使水分、蛋白質(zhì)和細胞成分漏出至肺間質(zhì)和肺泡內(nèi)。②肺泡表面活性物質(zhì)減少，活性降低，肺泡表面張力增大，形成肺水腫。③缺血再灌注損傷[12, 13]。④炎癥介導反應。在本實驗中，夾閉法OLV有可能受到更多的機械牽張，這是無法排除的影響因素之一。AQP-5的表達與時間的相關性受上述方面所影響。有研究表明兔OLV時肺組織氧化應激反應的水平顯著升高，隨著OLV時間的延長，這種趨勢表現(xiàn)的更加明顯[14]。從上述機制可以見，單肺通氣時間越長，再進行復張時，復張性肺水腫有可能越嚴重。有人認為OLV期間間斷雙肺通氣可減輕肺損傷[15]?？s短OLV時間是提高手術的安全性有效途徑之一。多長時間的一側(cè)肺不張在安全范圍內(nèi)，是麻醉及手術過程中需要充分注意的問題。應用AQP-5的生理功能防治肺水腫，增加單肺通氣的安全性，增大安全時限的范圍以適應更多復雜的手術，有進一步研究的意義。劉文粵等進行的臨床研究結果表明，在檢測肺動脈壓(PA)條件下，減少非通氣側(cè)肺血流在單肺通氣期間可減少肺內(nèi)分流，明顯改善動脈血氧[16]。在臨床上應用部分阻斷或間斷性地阻斷血流行單肺通氣，同時增加AQP-5的含量和活性，可能有利于保證循環(huán)的穩(wěn)定和減少肺水腫，更利于手術實施，值得更深入地研究。綜上所述，機械通氣可引起AQP-5表達的下調(diào)，單肺通氣下更加明顯，且與時間相關。夾閉法單肺通氣較插管過深法單肺通氣AQP-5表達的下調(diào)出現(xiàn)更早程度更大。參 考 文 獻[1] Krane C M, Fortner C N, Hand A R, et al. 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