呼吸內(nèi)科 牛澤群 碩士研究生 楊拴盈 教授慢性肺源性心臟病簡稱慢性肺心病，是我國的一種常見病。東北、西北、華北地區(qū)患病率高于南方地區(qū)，農(nóng)村患病率高于城市，并隨年齡增高而增加。冬季氣候干燥、寒冷，極易誘發(fā)呼吸道感染，使肺心病加重和惡化。因此，肺心病患者做好預(yù)防工作，對安全過冬尤為重要。第一：防止上呼吸道感染上呼吸道感染是肺心病急性發(fā)作的主要誘因。因此，肺心病患者應(yīng)嚴(yán)防上呼吸道感染。平時(shí)要加強(qiáng)鍛煉，多到戶外空氣新鮮的環(huán)境中練習(xí)深呼吸，吹口哨，縮唇呼吸，以改善呼吸肌力量，增加肺活量，增強(qiáng)機(jī)體免疫力；注意御寒，防止冷空氣刺激；隨氣候變化增減衣物，以免引起感冒而加重病情。此外冬季還應(yīng)注意居室的溫度、濕度，定時(shí)開窗通風(fēng)，保持空氣流通新鮮。第二：保持呼吸道通暢通氣障礙是肺心病加重的主要因素。所以，必須設(shè)法保持呼吸道通暢。痰咳不出，會加重呼吸道阻塞；多飲水、熱蒸汽或霧化吸入有利于濕潤呼吸道，稀釋稠痰；多活動、有意識咳嗽等均有利于痰液排出。當(dāng)然，配合服用氨溴索等化痰藥物效果更好。第三：家庭吸氧治療吸氧可明顯減緩肺心病的進(jìn)展，降低肺動脈壓力，減少肺心病病死率，是迄今延長肺心病患者生存時(shí)間最可靠的方法之一。肺心病加重期的氧療原則是：長期、持續(xù)、低流量（1~23升/分鐘）吸氧。一般應(yīng)持續(xù)每天14小時(shí)以上，間歇應(yīng)在白天，睡眠時(shí)不要間斷。近年，吸氧療法已普及到家庭。第四：加強(qiáng)飲食調(diào)養(yǎng)肺心病人呼吸所消耗的能量要比正常人大，又因內(nèi)臟淤血、水腫而食欲差，吸收又不佳。所以，多數(shù)病人營養(yǎng)不良，體重減輕，低蛋白血癥，免疫力低下，容易導(dǎo)致感染，加重病情，以此形成惡性循環(huán)。因此，調(diào)節(jié)肺心病的飲食營養(yǎng)是十分重要的。應(yīng)給病人以優(yōu)質(zhì)蛋白（蛋、奶、魚等）及富含維生素、纖維素、易消化的飲食（如水果和蔬菜等），不要過度限鹽，因?yàn)榈望}可加重乏力、食欲不振，甚至惡心、嘔吐，加重營養(yǎng)不良。但有水腫及心功能不全的病人應(yīng)控制食鹽量，以免加重呼吸和心臟負(fù)擔(dān)。當(dāng)然，保持大便通暢對于肺心病患者也是很重要的。如果條件許可，可在醫(yī)師指導(dǎo)下服用冬蟲夏草、胸腺肽等，可提高免疫力，香菇、菌類對提高免疫力也有一定的作用。第五：發(fā)病及時(shí)治療肺心病急性發(fā)作或病情加重時(shí)，應(yīng)在醫(yī)生指導(dǎo)下及時(shí)治療，避免病情進(jìn)一步加重，并加強(qiáng)護(hù)理。

南巖東1 楊拴盈2 金發(fā)光1 田應(yīng)選3 霍淑芬2 杜潔4（1.第四軍醫(yī)大學(xué)唐都醫(yī)院呼吸內(nèi)科，西安 717308；2. 西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院呼吸內(nèi)科，西安 710004；3.陜西省人民醫(yī)院老年呼吸科 710068；4.陜西省人民醫(yī)院內(nèi)科 710068）摘要：目的：應(yīng)用高通量蛋白質(zhì)組學(xué)及生物信息學(xué)技術(shù)分析肺鱗癌表達(dá)蛋白質(zhì)譜，篩選肺癌標(biāo)志蛋白質(zhì)，為肺鱗癌發(fā)病機(jī)制、早期診斷及治療提供有價(jià)值的線索。方法：6例手術(shù)后新鮮肺鱗癌組織，通過激光捕獲顯微切割（laser capture microdissection，LCM）分離純化腫瘤細(xì)胞并提取可溶性總蛋白；多維液相色譜-離子阱串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)(也稱鳥槍法蛋白質(zhì)組學(xué)，shot-gun proteomics)對蛋白質(zhì)進(jìn)行分離、鑒定；進(jìn)一步通過生物信息學(xué)工具預(yù)測肺鱗癌細(xì)胞表達(dá)蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)、分子功能、生物通路及蛋白質(zhì)相互作用，并篩選潛在的標(biāo)志蛋白。結(jié)果：LCM共收集60個(gè)cap，平均每個(gè)LCM-cap收集感興趣細(xì)胞數(shù)約12000個(gè)，其同質(zhì)性大于95％?？扇苄钥偟鞍捉?jīng)多維液相色譜-離子阱串聯(lián)質(zhì)譜共鑒定出860個(gè)非冗余蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)包括分子量、等電點(diǎn)、平均疏水性、跨膜結(jié)構(gòu)域、亞細(xì)胞定位、轉(zhuǎn)錄后修飾和組織分布經(jīng)過在線生物信息學(xué)工具分析；蛋白質(zhì)生物學(xué)功能基于GO軟件和KEGG生物學(xué)通路分析，根據(jù)其注解，篩選出3個(gè)有價(jià)值的蛋白質(zhì)，即分裂素活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MHPK），粘聯(lián)素A1（annexin A1，ANXA1），高移動組蛋白B1（high mobility group protein B1，HMGPB1）作為肺鱗癌候選的標(biāo)志蛋白。結(jié)論：鳥槍法蛋白質(zhì)組學(xué)可大規(guī)模分離、鑒定腫瘤細(xì)胞表達(dá)蛋白質(zhì)，基于生物信息學(xué)篩選的標(biāo)志蛋白質(zhì)可能成為肺癌診斷和治療的分子靶點(diǎn)。關(guān)鍵詞：肺鱗癌；鳥槍法蛋白質(zhì)組學(xué)；生物信息學(xué)；分子功能；標(biāo)志蛋白質(zhì)ABSTRACT: Objective To explore the pathogenesis and screen biomarkers of early diagnosis and treatment for lung squamous cell carcinoma (SQCC).Methods: Tumor cells were isolated and purified bylaser capture microdissection（LCM）from 6 cases of fresh tissue of lung SQCC after operatoin and total solution proteins were extracted. Proteins were isolate and identified by mutiple dimension liquid chromatography (MDLC) and ion trap tandem mass spectrum technology (Shot-gun Proteomics) . The physio-chemical properties, molecular functoin, biological pathway and interaction of the expressoin proteins were predicted and biomarkers were screened using bioinformatics tools. Results: A total of 60 LCM-caps were collected and about 12000 cells were harvested from every LCM-cap. 860 non–redundant proteins were identified using shot-gun proteomics technology. The physio-chemical properties, including molecular weight (MW), point of isoelectric (PI), grand average of hydropathy (GRAVY), trans-membrane helices (TMH), subcellular location, post-transcription modification (PTM) and tissue distribution were analyzed using bioinformatics tools online and were further indiciated in statistical graph. Biological function was analyzed based on gene ontology (GO) software and kyoto encyclopedia of genes and genomes (KEGG) biological pathway. Three valuable proteins, including mitogen-activated protein kinase (MHPK), annexin A1 (ANXA1) and high mobility group protein B1(HMGPB1) were screened candidate biomarkers of lung SQCC according to functoin annotatoin.Conclusoin: Shot-gun proteomics can globally isolated and identified the expression protein of tumor cell. The screened biomarkers based on bioinformatics may become molecular target point of dianosis and treatment for lung cancer . KEY WORDS: lung squamous cell carcinoma; shot-gun proteomics; bioinformatics; molecular function; biomarker protien肺癌目前已成為世界范圍內(nèi)發(fā)病率最高的惡性腫瘤，缺乏有效的早期診斷及治療措施，5年生存率不足15％[1]。因此，闡明肺癌發(fā)生的分子機(jī)制，尋找其特異性靶向蛋白已成為肺癌研究的一項(xiàng)迫切任務(wù)。為了大規(guī)模、全景式和從整體的角度探索肺鱗癌細(xì)胞全蛋白表達(dá)譜，我們采用了激光捕獲顯微切割（laser capture microdissection，LCM）、多維液相色譜-離子阱串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)(也稱鳥槍法蛋白質(zhì)組學(xué)，shot-gun proteomics)對6例肺鱗癌細(xì)胞表達(dá)蛋白質(zhì)進(jìn)行分離、鑒定，進(jìn)一步通過生物信息學(xué)工具預(yù)測肺鱗癌細(xì)胞表達(dá)蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)、分子功能、生物通路及蛋白質(zhì)相互作用，并篩選出的3個(gè)潛在的標(biāo)志蛋白，為肺鱗癌發(fā)病機(jī)制、早期診斷及治療提供有價(jià)值的線索。1 資料與方法1.1 臨床資料 從2005年2月至2007年2月共收集6例肺鱗癌患者腫瘤組織，所有患者均具有完整的臨床資料、術(shù)前未行放療及化療、經(jīng)手術(shù)切除、病理證實(shí)。其中男5例，女1例； 年齡47-70歲；腫瘤P-TNM分期：Ia期1例, Ib2例, IIb期3例；腫瘤分化：高分化1例，中分化3例，低分化2例。1.2 主要儀器 冰凍切片機(jī)（MICROM/HM5000，德國）；Pixcell激光捕獲儀（ARCUTUROUS Inc，美國）；分光光度儀（P-2000,Hitachi公司），純水裝置（Millpore公司），質(zhì)譜儀（LTQ），MDLC（GE Healthcare）。1.3 主要試劑 所有緩沖液均用Milli-Q 水（Millipore, Bedford, MA, USA）配制。二硫蘇糖醇（DTT）、尿素（Urea）、3-膽酰胺丙基－二乙銨－丙磺酸（CHAPS）、三羥甲基氨基乙烷（Tris）、十二烷基磺酸鈉（SDS）、Bradford 法定量液等試劑購自Bio-Rad公司（Hercules, CA, USA）；碘代乙酰胺（IAA）、過硫酸銨（Ammonium persulphate）、甲酸（Formic acid, FA）、胍（Guanidine）、氯化鈉（NaCl）等試劑購自Sigma公司（St. Louis, MO, USA）；HPLC級別乙腈（ACN）和甲醇（Methanol）購自Fisher公司（Fair Lawn, NJ, USA）；三氟乙酸（TFA）購自Merck公司（Schuchardt, Hohenbrunn, Germany）；氫氧化鈉購自Fisher（Merck，Darmstadt，German）公司；胰蛋白酶（Trypsin，sequencing grade）購自Promega公司（Madison, WI, USA）。1.4 組織標(biāo)本的處理 帶消毒手套，用無菌剪刀剪取手術(shù)后新鮮（30分鐘內(nèi)）肺腫瘤組織，大小約0.4m3，生理鹽水反復(fù)清洗去除血液，并剪去壞死組織。處理后的組織立即置于-80 ℃保存。1.5 LCM 將組織移入-28℃冰凍切片機(jī)，OCT包埋；冰凍切片一張（10mm），常規(guī)H＆E染色，光學(xué)顯微鏡下觀察，確定組織無明顯炎癥、壞死；對余下的組織冰凍切片（8mm），改良H＆E染色，其方法是：將試劑瓶置于冰上，蘇木精1s，蒸餾水洗10s（緩慢），伊紅10s，85％乙醇10s，90％乙醇10s，無水乙醇Ⅰ10s，無水乙醇Ⅱ10s，二甲苯Ⅰ2min，二甲苯Ⅱ2min；改良H＆E染色后的組織切片立即行LCM，條件為：光束直徑7.5um，脈沖持續(xù)時(shí)間15.5ms，光束能量80mW，每張切片捕獲時(shí)間不超過40分鐘。1.6 蛋白質(zhì)提取及定量 每個(gè)LCM cap上的細(xì)胞，加裂解液（9.5M尿素，65mM DTT，4%CHAPS，0.2%IPGbuffer，裂解液和酶抑制劑以體積比50：1混合）約20l，吹打cap表面裂解細(xì)胞10次，轉(zhuǎn)入離心管中。依次操作組內(nèi)所有cap，合并在一個(gè)離心管中，總體積控制在200 l左右。超聲破碎細(xì)胞（80W，5次，每次10秒，間隔15秒，冰上完成）。離心，15,000g，45分鐘，取上清，加入5倍體積的純丙酮（-20℃），沉淀蛋白質(zhì)，去除染色劑。沉淀蛋白質(zhì)復(fù)溶于適量的裂解液中，Bradford法定量，分裝成100g/管，置于500l離心管中，-80℃保存。 1.7 蛋白質(zhì)質(zhì)譜鑒定 取100g加trypsin，trypsin : protein=1：20-1：50，37℃，20hr； 離心12,000 rpm，4℃，90min， -80℃保存。使用MDLC-LTQ進(jìn)行分析，C18柱（0.15mm直徑，15cm長），自動進(jìn)樣器上樣，樣品經(jīng)過C18Trap柱脫鹽，然后在C18柱上進(jìn)行分離（A相為0.1% FA的Millpore水，B相為0.1%FA 84%乙腈水溶液，梯度為2小時(shí)內(nèi)從4%的B相上升到50%的B相），microspray模式。質(zhì)譜掃描條件設(shè)定為一個(gè)400—2000的全掃描 (full scan) 后面進(jìn)行全掃描中前3個(gè)最高峰的MS/MS掃描，其中動態(tài)排除 (dynamic exclusion)的設(shè)定是：重復(fù)次數(shù)(repeat count)為1，重復(fù)容忍時(shí)間 (repeat duration)為0.5 min，動態(tài)排除時(shí)間 (exclusion duration)為3.0 min。1.8 數(shù)據(jù)庫查詢 產(chǎn)生的MS/MS用TurboSEQUEST BioWorksTM 3.0軟件自動搜索IPI人類蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫，所有鑒定得到的肽段數(shù)據(jù)必須滿足以下一些條件：(1) charge=1，XCorr=1.9； charge=2，XCorr= 2.2； charge=3，XCorr= 3.75；(2) Delta Cn= 0.1。同時(shí)在Swiss-Prot/TrEMBL和NCBI數(shù)據(jù)庫查詢蛋白質(zhì)，比較不同數(shù)據(jù)庫查詢結(jié)果。1.9 生物信息學(xué)分析 蛋白質(zhì)分子量（molecular weight, MW）、等電點(diǎn)（piont of isoelectric, PI）、平均疏水性（grand average of hydropathy, GRAVY）通過蛋白質(zhì)組學(xué)網(wǎng)(http://www.expasy.org/tools) 蛋白質(zhì)專家分析軟件（expert proteins analysis system, ExPASy）分析；跨膜結(jié)構(gòu)通過TMHMMv2.0 (http://www. cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0) 軟件預(yù)測；亞細(xì)胞定位基于pTARGET軟件（http://bioapps.rit.albany.edu/pTARGET）分析；轉(zhuǎn)錄后修飾（post-transcription modification，PTM)，包括GPI錨定糖基化（GPI Anchor Glycosylation），O-糖基化，N-糖基化及磷酸化分別通過在線Big-PI Predictor, NetNGlyc 1.0 Server, NetOGlyc3.1 Server和GPS2.0分析。蛋白質(zhì)功能分類包括分子功能，細(xì)胞組分、生物學(xué)進(jìn)程基于Gene Ontology (GO)注解軟件（http://http://www.ebi.ac.uk/GOA/）分析。蛋白質(zhì)生物學(xué)通路依賴于kyoto encyclopedia of genes and genomes (KEGG) http://www.genome.ad.jp/kegg/pathway.html）軟件分析，并根據(jù)其注解，確定與腫瘤發(fā)生密切相關(guān)的關(guān)鍵信號通路，初步篩選肺鱗癌標(biāo)志蛋白質(zhì)。2 結(jié)果2.1 蛋白質(zhì)定量：6例肺鱗癌組織標(biāo)本經(jīng)LCM共收集60個(gè)cap，平均每個(gè)LCM-cap收集感興趣細(xì)胞數(shù)約12000個(gè)；高倍光學(xué)顯微鏡觀察，LCM-cap上肺鱗癌細(xì)胞的同質(zhì)性大于95％。分別于丙酮沉淀前后，先對單個(gè)LCM cap上細(xì)胞提取的蛋白質(zhì)行Bradoford法定量，然后對總共60LCM cap上細(xì)胞提取的蛋白質(zhì)行Bradoford法定量，其結(jié)果如表1。表1 丙酮沉淀前后可溶性蛋白質(zhì)定量結(jié)果丙酮沉淀單個(gè)cap蛋白質(zhì) (g) ( ±s)總蛋白（g）前4.14±0.36248.20后1.69±0.12101.892.2 蛋白質(zhì)鑒定：使用MDLC，C18Trap柱脫鹽，分離2小時(shí)，獲得了LCM肺鱗癌細(xì)胞表達(dá)蛋白質(zhì)酶解肽段的總離子流圖。LC分離后的混合肽段，經(jīng)電噴霧離子阱串聯(lián)質(zhì)譜，先由第一級質(zhì)量分析器獲得其一級質(zhì)譜圖，然后在一級質(zhì)譜圖中挑選出需要進(jìn)一步分析的母離子進(jìn)入碰撞室碰撞誘導(dǎo)解離(collision- induced dissociation, CID)，產(chǎn)生碎片離子獲得二級質(zhì)譜圖，并鑒定出該肽段氨基酸序列。原始數(shù)據(jù)使用BioworksTM軟件查庫（人類）為了避免冗余，我們采用了較嚴(yán)格的過濾參數(shù)charge=1，XCorr=1.9；charge=2，XCorr=2.2；charge=3，XCorr=3.75；同時(shí)應(yīng)用Swiss-Prot/TrEMBL and NCBI驗(yàn)證結(jié)果，最終又通過刪除同源蛋白的方法，共鑒定出860個(gè)非冗余蛋白質(zhì)（不包括角蛋白），所有蛋白質(zhì)至少有1個(gè)唯一肽段，部分蛋白質(zhì)的唯一肽段數(shù)達(dá)10個(gè)。2.3 蛋白質(zhì)理化性質(zhì)：我們通過生物信息學(xué)工具總結(jié)了肺鱗癌細(xì)胞表達(dá)蛋白質(zhì)各種理化性質(zhì)。圖1顯示了鑒定蛋白質(zhì)MW分布從最小3.0KD至最大3800.5KD，其中120（10%）個(gè)蛋白質(zhì)MW小于20KD，80（8%）個(gè)蛋白質(zhì)MW大于100KD；而且，50（8%）個(gè)MW極大（MW>200KD）或極小（MW<10KD）蛋白質(zhì)也被鑒定。PI的分布（圖2）從2.0至14.0，15（8%）個(gè)極酸（PI<4.0）20個(gè)（14%）極堿（PI>10）蛋白質(zhì)被鑒定。GRAVY通過Kyte-Doolittle模型來計(jì)算（圖3），12（10%）個(gè)蛋白質(zhì)具有疏水性，30（20%）個(gè)蛋白質(zhì)具有親水性。對于蛋白質(zhì)的TMH預(yù)測如圖4所示，共150個(gè)蛋白質(zhì)具有跨膜a螺旋，其中50（7.0%）蛋白質(zhì)有1個(gè)跨膜區(qū)，22（6.0%）個(gè)蛋白質(zhì)有2個(gè)跨膜區(qū)，跨膜區(qū)大于等于3的蛋白質(zhì)數(shù)目為56（20%）個(gè)。鑒定蛋白質(zhì)亞細(xì)胞定位通過pTARGET算法預(yù)測，如圖5所示，胞漿蛋白數(shù)目為260（30%）個(gè)，其它蛋白質(zhì)分別位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（100，10%）、高爾基復(fù)合體（100，10%）、線粒體（100，10%）、細(xì)胞核（100，10%）、細(xì)胞膜（100，10%）。PTM分別為：3個(gè)蛋白質(zhì)具有GPI錨定糖基化，102個(gè)蛋白質(zhì)具有N-糖基化，113個(gè)蛋白質(zhì)具有O-糖基化，58個(gè)蛋白質(zhì)具有磷酸化（圖6）。鑒定蛋白質(zhì)除分布于肺組織外，部分蛋白質(zhì)還分布于骨髓、腦、直腸、心臟、肝臟等組織（圖7）。2.4 蛋白質(zhì)功能分析：基于GO軟件對蛋白質(zhì)功能分析顯示，鑒定的860個(gè)蛋白質(zhì)對應(yīng)于一種或者一種以上的分類注釋，分子功能方面（圖8），264個(gè)蛋白質(zhì)具有催化活性（catalytic activity），9個(gè)蛋白質(zhì)具有運(yùn)動活性（motor activity）, 18個(gè)蛋白質(zhì)具有翻譯調(diào)節(jié)活性（translation regulator activity）,65個(gè)蛋白質(zhì)具有結(jié)構(gòu)分子活性（structural molecule activity）, 42個(gè)蛋白質(zhì)具有轉(zhuǎn)運(yùn)活性（transporter activity）, 51個(gè)蛋白質(zhì)具有酶調(diào)節(jié)活性（enzyme regulator activity）, 40個(gè)蛋白質(zhì)具有轉(zhuǎn)綠調(diào)節(jié)活性（transcription regulator activity）, 8個(gè)蛋白質(zhì)具有抗氧化活性（antioxidant activity）, 28個(gè)蛋白質(zhì)具有分子轉(zhuǎn)導(dǎo)活性（molecular transducer activity）；生物進(jìn)程分析結(jié)果（圖9）為18個(gè)蛋白質(zhì)具有生長功能（growth）, 6個(gè)蛋白質(zhì)具有細(xì)胞殺傷功能（cell killing）, 177個(gè)蛋白質(zhì)具有細(xì)胞定位功能（localization）,9個(gè)蛋白質(zhì)具有定位修復(fù)功能（maintenance of localization）等。將本研究中鑒定的蛋白質(zhì)定義為測試集，全人類蛋白質(zhì)組定義為參考集，通過超幾何分布蛋白質(zhì)富集分析表明，480個(gè)蛋白質(zhì)富集在30個(gè)GO分類注釋，并在肺鱗癌細(xì)胞中顯著高表達(dá)（P<0.05或P<0.01）（圖10）。其中一些具有細(xì)胞增殖、細(xì)胞粘附、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、凋亡、抗氧化功能的蛋白質(zhì)與腫瘤的發(fā)生、侵襲密切相關(guān)。進(jìn)一步KEGG生物通路搜索發(fā)現(xiàn)，3個(gè)蛋白質(zhì)，即分裂素活化蛋白激酶（Mitogen-activated protein kinase，MHPK），粘聯(lián)素A1（Annexin A1，ANXA1），高移動組蛋白B1（High mobility group protein B1，HMGPB1）涉及凋亡通路，p53信號通路，泛素介導(dǎo)的蛋白酶通路，可以作為肺鱗癌候選的標(biāo)志蛋白（圖11）。3．討論目前腫瘤蛋白質(zhì)表達(dá)譜有兩個(gè)互補(bǔ)的研究策略[2]：差異蛋白質(zhì)表達(dá)譜和全蛋白表達(dá)譜。差異蛋白質(zhì)表達(dá)譜主要是指細(xì)胞或組織在不同條件下的蛋白質(zhì)表達(dá)譜的差異分析（differences in protein expression）；全蛋白表達(dá)譜（global protein profiles）側(cè)重檢測一個(gè)細(xì)胞或組織里蛋白質(zhì)的表達(dá)情況，是針對細(xì)胞或組織的全部蛋白質(zhì)，也就是著眼于整個(gè)蛋白質(zhì)組或某一亞單位蛋白質(zhì)組。Celis等[3]用2-DE分析數(shù)百個(gè)膀胱癌患者標(biāo)本的蛋白質(zhì)表達(dá)情況，建立了膀胱癌的蛋白組數(shù)據(jù)庫，并注釋蛋白質(zhì)的生物學(xué)特性及與疾病進(jìn)程的關(guān)系，這是目前所能獲得的最大的和注釋最好的數(shù)據(jù)之一。Ou等[4]對人肝癌細(xì)胞系HCC-M蛋白表達(dá)進(jìn)行分析鑒定，建立HCC-M蛋白質(zhì)表達(dá)數(shù)據(jù)庫。此外，結(jié)腸癌、乳腺癌、白血病等腫瘤的細(xì)胞系或腫瘤組織的數(shù)據(jù)庫也已經(jīng)發(fā)布[5，6]。這些數(shù)據(jù)為腫瘤的深入研究提供了豐富的資源。肺癌由于組織成分復(fù)雜、病理類型多樣、細(xì)胞異質(zhì)性明顯，因此樣品制備是全蛋白表達(dá)譜研究的關(guān)鍵。本研究中，我們采用LCM技術(shù)，從腫瘤組織中特異性分離出實(shí)質(zhì)細(xì)胞，提取可溶性總蛋白質(zhì)，分別于丙酮沉淀前后定量分析。結(jié)果顯示，無論單個(gè)cap的蛋白質(zhì)量還是總蛋白量，丙酮沉淀前后均明顯差異，提示丙酮沉淀方法對可溶性蛋白質(zhì)有一定的影響，如何既能使丙酮與染色劑充分結(jié)合，又不致丟失蛋白質(zhì)，這一問題將有待深入研究。盡管如此，其蛋白質(zhì)量仍然可以滿足shot-gun蛋白質(zhì)組學(xué)上樣的要求。Shot-gun蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)具有高效、快速、自動化、低檢測限等優(yōu)點(diǎn)，所獲蛋白質(zhì)圖分辨率高、重復(fù)性好，有效克服了2-DE操作費(fèi)時(shí)費(fèi)力，對于極端酸性、堿性、極難溶解的、疏水性膜蛋白及分子量很高或很低的蛋白質(zhì)難以分離的缺點(diǎn)。本研究通過多維液相色譜技術(shù)對肺鱗癌細(xì)胞表達(dá)蛋白質(zhì)酶解肽段分離，獲得了總離子流圖；分離后的肽段經(jīng)電噴霧、離子阱串聯(lián)質(zhì)譜獲得其一、二級質(zhì)譜圖。我們采用了比較苛刻的數(shù)據(jù)篩選和過濾條件，最終又通過刪除同源蛋白的方法，共鑒定出860個(gè)蛋白質(zhì)。肽段分析顯示，大部分鑒定蛋白質(zhì)的唯一肽段數(shù)大于1，部分蛋白質(zhì)的唯一肽段數(shù)超過10個(gè)，表明鑒定蛋白質(zhì)結(jié)果是可靠的。雖然目前從生物學(xué)功能的角度來說，關(guān)于究竟是低豐度蛋白還是高豐度蛋白更有意義仍然在爭論之中，但是首先大規(guī)模盡可能多地鑒定出細(xì)胞表達(dá)的蛋白質(zhì)是解決這些爭論最基本的前提。由于蛋白質(zhì)存在翻譯后的修飾，使蛋白質(zhì)數(shù)量和種類遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于相應(yīng)的基因組的基因數(shù)量，而且蛋白質(zhì)功能與其空間定位密切相關(guān)，蛋白質(zhì)彼此相互作用、相互影響，使研究蛋白質(zhì)的復(fù)雜性遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過了基因組研究[7]。目前，大規(guī)模蛋白質(zhì)組表達(dá)譜研究及功能分析一般采取基于數(shù)據(jù)庫搜索的策略。本研究中鑒定蛋白質(zhì)的分子量、等電點(diǎn)、疏水性、跨膜結(jié)構(gòu)域等理化性質(zhì)，通過統(tǒng)計(jì)圖形直觀的顯示了其分布特征。功能分析采用了國際蛋白質(zhì)注解的標(biāo)準(zhǔn)方案GO， KEGG生物通路，結(jié)果表明860個(gè)蛋白質(zhì)可分為9類分子功能和10類生物學(xué)進(jìn)程，共參與了30個(gè)KEGG生物學(xué)通路。其中對參與細(xì)胞增殖、粘附、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、凋亡等與腫瘤發(fā)生密切相關(guān)的信號通路的分析，初步篩選出3個(gè)有價(jià)值的肺鱗癌標(biāo)志蛋白質(zhì)，分別是MHPK, ANXA1, HMGPB1。MHPK活化蛋白激酶屬于蛋白激酶超家族，通過磷酸化轉(zhuǎn)錄因子來啟動和調(diào)節(jié)分化細(xì)胞的減數(shù)分裂、有絲分裂和分裂后期的功能。Zhao等[8]發(fā)現(xiàn)HeLa細(xì)胞系中RNAi介導(dǎo)的LIV-1明顯抑制腫瘤細(xì)胞的增殖、克隆、轉(zhuǎn)移及侵襲的能力，而LIV-1抑制伴有p44/42 MAPK、phospho-p44/42 MAPK表達(dá)水平的下調(diào)。研究表明，LIV-1 mRNA在宮頸癌原位過表達(dá)，通過靶向的MAPK 介導(dǎo)宮頸癌細(xì)胞侵襲。Yoo等[9]發(fā)現(xiàn)頭頸部鱗癌細(xì)胞系HN6和HN30通過口服抗腫瘤活性藥物BMS-275183紫衫烷，MAPK表達(dá)水平可以下降。ANXA1屬鈣結(jié)合蛋白，是血小板源生長因子、胰島素生長因子、肝細(xì)胞生長因子及散射因子的受體酪氨酸激酶激酶；同時(shí)其作用也涉及到花生四烯酸的代謝和表皮生長因子受體酪氨酸激酶途徑。ANXA1的表達(dá)已在各種腫瘤被發(fā)現(xiàn)，其中上調(diào)的有胰腺癌，乳腺癌、肝癌、胃癌；表達(dá)下調(diào)的有前列腺癌、食管鱗癌。ANXA1在腫瘤形成的作用可能具有組織特異性[10]。HMGPB1是一個(gè)與癌癥相關(guān)的多功能的細(xì)胞因子，高表達(dá)的HMGPB1導(dǎo)致了許多腫瘤細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移，如乳腺癌、大腸癌、黑色素瘤等。Akaike等[11]發(fā)現(xiàn)胃癌細(xì)胞系中HMGPB1表達(dá)與腫瘤微環(huán)境中巨噬細(xì)胞的浸潤呈正相關(guān)，并調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境的炎癥反應(yīng)。Kuniyasu H等[12]發(fā)現(xiàn)HMGB1可能通過細(xì)胞間信號轉(zhuǎn)導(dǎo)誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞的生長抑制和凋亡?？傊狙芯繎?yīng)用shot-gun蛋白質(zhì)組學(xué)研究策略，全景式分離、鑒定出肺鱗癌細(xì)胞蛋白質(zhì)表達(dá)譜，進(jìn)一步通過生物信息學(xué)對表達(dá)蛋白質(zhì)譜理化性質(zhì)和生物學(xué)功能進(jìn)行分析，篩選出3個(gè)候選的標(biāo)志蛋白質(zhì)，有望作為肺鱗癌診斷、治療的靶點(diǎn)。當(dāng)然，進(jìn)一步對其靈敏度、特異度及陽性預(yù)測值的研究仍然是必需的。參考文獻(xiàn)[1] 楊拴盈，楊德昌．肺癌診斷及治療進(jìn)展[J]．中華結(jié)核和呼吸雜志，2004，27 (1)：18-19．[2] Simpson RJ, Dorow DS. 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大家對于呼吸介入可能不了解。各種原因引起的氣道結(jié)構(gòu)或氣道內(nèi)異物，比如良惡性疾病所致氣道狹窄狹窄，氣道異物，肺部結(jié)節(jié)需要明確性質(zhì)等，可嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量，甚至危及生命。呼吸介入可借助于先進(jìn)的支氣管鏡系統(tǒng)快速解決這一問題，創(chuàng)傷小，費(fèi)用低，方便快捷。