文獻綜述 卡托普利干預細胞凋亡作用研究進展 卡托普利是第一個口服有效的血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑，自從1981年由美國FDA批準用于治療高血壓以來，卡托普利在治療充血性心力衰竭，心肌梗死后的心室重構(gòu)和糖尿病腎病中取得了良好的療效。它在血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑中應用范圍最廣[1]。隨著相關(guān)基礎(chǔ)科學的迅猛發(fā)展和對卡托普利藥理作用研究的深入，近來人們在大量的動物和臨床實驗中發(fā)現(xiàn)卡托普利具有抑制和誘導細胞凋亡的雙重作用[2-7]，本文采用文獻回顧的方法對卡托普利干預細胞凋亡的作用及相關(guān)機制作一綜述。1卡托普利的藥理作用卡托普利是含有巰基（SH）的血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑,它不但具有其他的血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑藥理作用：（1）阻止血管緊張素II(AngII)的生成和作用；（2）保存緩激肽的活性；（3）保護血管內(nèi)皮細胞與抗動脈粥洋硬化作用；（4）抗心肌缺血和心肌保護作用；（5）增加糖尿病病人對胰島素的敏感性；（6）阻止心血管病理性重構(gòu)，而且能通過所含有的巰基清除氧自由基，抑制脂質(zhì)過氧化反應，起到穩(wěn)定線粒體膜的作用[8]，此外卡托普利還具有抑制單核巨噬細胞產(chǎn)生腫瘤壞死因子，白細胞介素等細胞因子的免疫學效應[9]。2: 細胞凋亡2.1 細胞凋亡的概念及其基因調(diào)控細胞凋亡是指在一定的生理和病理條件下,遵循自身的程序通過啟動內(nèi)部機制,主要是內(nèi)源性DNA內(nèi)切酶的激活,從而結(jié)束其生命的過程.目前的研究表明，細胞凋亡是基因調(diào)控的一種細胞死亡的特殊形式，其調(diào)控基因可分為促凋亡基因，包括野生型P53.c-myc，c-fas，c-jun，bcl-bax，ras，IC等基因；抑凋亡基因主要包括Bcl-2和突變型P53。自1972年Kerr[10]等首次提出細胞凋亡概念以來, 細胞凋亡一直是近年來醫(yī)學界的研究熱點.2.2細胞凋亡的通路細胞凋亡的通路主要有兩條,一條是死亡受體途徑[11]：死亡受體屬于腫瘤因子受體(TNFR)超家族,包括Fas, TNFR1,DR3 ,DR4和DR5,在胞內(nèi)部分含有一個死亡域(DD),以此招募下游的凋亡蛋白。Fas配體是一個同源三聚體，每個三聚體分子結(jié)合3個Fas分子。一旦與三聚體的配體相結(jié)合，F(xiàn)as通過胞內(nèi)段的DD和FADD羧基端的DD之間的相互作用，募集胞質(zhì)中的銜接蛋白FADD。FADD氨基端含有DED，此DED和Caspase-8原域的DED相互作用，把Caspase-8募集到Fas區(qū)域。Fas、FADD和Caspase-8形成了死亡誘導信號復合體（DISC）。Caspase-8酶原有弱的蛋白水解活性，在DISC中Caspase-8由于寡聚化水解活性增強，而自我剪切活化 。活化的Caspase-8釋放到細胞質(zhì)中即激活Caspase—3，引起細胞凋亡；另一條是線粒體途徑[12]：線粒體通路[2]：各種促凋亡信號如DNA損傷、生長因子去除等誘導線粒體釋放細胞色素C，在ATP/dATP存在的情況下，細胞色素C結(jié)合到Apaf-1的WD40重復區(qū)域，促使Apaf-1寡聚化，形成Apaf-1-細胞上色素C多聚復合體。此復合體通過Apaf-1的氨基端的CARD與Caspase-9原域的CARD之間的蛋白—蛋白相互作用，以1：1比例募集胞質(zhì)的Caspase—9。Caspase—9酶原之間因相互靠近自我剪切而活化。Caspase—9作為起始半胱氨酸蛋白酶激活下游的Caspase—3促使細胞凋亡。3卡托普利抑制細胞凋亡3.1卡托普利抑制AngII誘導的細胞凋亡AngII對細胞凋亡有重要的影響，但作用機制較復雜，不同的細胞表現(xiàn)出不同的作用：既可以引起細胞凋亡，也可以引起細胞增生[13]，這主要與AngII和其相應的受體AT1，AT2結(jié)合所發(fā)揮的生物學效應有關(guān)。Goldenberg I[14]等實驗發(fā)現(xiàn)AngII與其相應的受體AT1，AT2結(jié)合并共同作用，在增加AT1，AT2受體蛋白的表達的同時并明顯上調(diào)促凋亡基因的表達，進而激活caspase-3導致細胞凋亡。但亦有研究表明：AT1受體和AT2受體與AngII結(jié)合而發(fā)揮的作用相反：即AT1受體與AngII結(jié)合具有促進細胞增生的作用；AT2受體與AngII結(jié)合具有誘導的細胞凋亡作用[15]。這與Liangxuguo[16]等應用卡托普利和氯沙坦干預由AngII所誘導的血管內(nèi)皮細胞凋亡的實驗內(nèi)結(jié)果相一致：氯沙坦作為AT1受體拮抗劑，雖然阻斷了AngII與AT1的結(jié)合,但對AngII所誘導的細胞調(diào)亡無影響，從而說明AT1受體在AngII所誘導的細胞凋亡過程中無明顯作用；而使用卡托普利能部分抑制AngII誘導的血管內(nèi)皮細胞凋亡，其可能機制為卡托普利通過抑制血管緊張素轉(zhuǎn)化酶的活性，阻止了AngI轉(zhuǎn)換為AngII，從而不但使AngII所產(chǎn)生的氧自由基和炎性介質(zhì)減少，而且部分阻斷AngII與其相應受體結(jié)合所至的細胞凋亡作用。同時，還能降低促凋亡基因表達，上調(diào)抗凋亡基因Bcl-2的表達，從分子水平發(fā)揮抗細胞凋亡的作用[17]。此外還與卡托普利能減少緩激肽的降解，增加NO的分泌有關(guān)[18]。3.2卡托普利抑制氧自由基誘導的細胞凋亡氧自由基可以通過直接損傷DNA，攻擊含有酶活性的蛋白質(zhì)，影響核基因轉(zhuǎn)錄，引發(fā)脂質(zhì)過氧化反應等多種途徑誘導細胞凋亡。這已經(jīng)在大量的實驗中得以證實。同時，亦有實驗證明用抗氧化劑或氧自由基清除劑干預氧自由基誘導的細胞凋亡，能通過阻止P53的激活。下調(diào).BAX的表達和降低Caspase-3的活性而抑制細胞凋亡[19]。而卡托普利本身含有巰基（SH），不但具有抑制微粒體脂質(zhì)過氧化反應及白細胞產(chǎn)生氧自自由基的作用，而且本身是強有力的氧自由基清除劑 [20]。Tambd[21]等研究發(fā)現(xiàn)卡托普利對缺血再灌注過程中產(chǎn)生氧自由基所至的細胞凋亡具有明顯的抑制作用，這與我國學者胡青松等[22-23]等研究發(fā)現(xiàn)卡托普利具有抑制羥自由基誘導血管內(nèi)皮細胞、心肌凋亡的結(jié)論相一致。由此可見，卡托普利通過抑制和清除氧自由基的雙重作用來阻止氧自由基氧化PT孔上的硫醇而激發(fā)PT孔開放，同時，卡托普利所含有巰基（SH）可使PT孔處于關(guān)閉狀態(tài)[24]，穩(wěn)定了線粒體膜電位，阻止Cyt-C及凋亡誘導因子（AIF）從線粒體中釋放，阻斷細胞凋亡的線粒體途徑，從而抑制細胞凋亡。同時卡托普利對線粒體復合體II-III質(zhì)子泵出速度和電子傳遞速度升高有調(diào)節(jié)作用，使質(zhì)子偶聯(lián)更緊密，從而保護線粒體的呼吸功能，改善細胞的能量代謝[25]，有效阻止氧自由基所造成的細胞內(nèi)鈣超載。3.3卡托普利阻止緩激肽降解而抑制細胞凋亡實驗證明卡托普利能通過減少緩激肽的降解，使增加的緩激肽通過與其β2受體結(jié)合,進而激活磷酸酯酶C(PLC),產(chǎn)生的IP3使細胞內(nèi)Ca2+釋放而一氧化氮合酶（NOS）和上調(diào)ecNOS，從而增加一氧化氮（NO）的產(chǎn)生[26]。NO對細胞具有雙重作用，即在通過產(chǎn)生氧自由基介導細胞凋亡的同時，可以通過抑制Caspase酶活性而產(chǎn)生抗細胞凋亡作用，作用結(jié)果與細胞類型和NO的量有關(guān)[27]。Dimmelers[18]等實驗證明NO能通過抑制Caspase酶活性而阻斷AngII所致的細胞凋亡作用，但Fukuok [28]等實驗發(fā)現(xiàn)NO能通過上調(diào)Fas及Bax的表達而介導細胞凋亡。因此我們可以認為卡托普利可能一方面通過適當增加NO水平，另一方面通過其所含有巰基（SH）而清除過量的NO產(chǎn)生的氧自由基而共同發(fā)揮抗細胞凋亡的作用。此外，通過緩激肽-NO 途徑可以激活蛋白激酶C，降低細胞代謝水平，降低ATP及氧的需求，改善細胞的能量代謝，阻止細胞凋亡[29]。3.4 其他最近研究發(fā)現(xiàn)卡托普利能阻斷由Fas受體介導細胞凋亡：UhalBD[4]等研究發(fā)現(xiàn)卡托普利通過降低肺泡上皮細胞表面的Fas和其配體（Fasl）的表達而抑制凋亡。此外Odakac Mizuochi T[30]等證實卡托普利通過干擾外周T細胞表面的Fas和Fasl之間的相互作用，并能降低凋亡過程中產(chǎn)生的Caspase-3類似物的活性而抑制凋亡。這為我們研究卡托普利在自身免疫病的應用開辟了新的道路。4卡托普利誘導細胞凋亡已有實驗證明卡托普利具有促進細胞凋亡的作用，Buemi M[5]等發(fā)現(xiàn)在實驗中卡托普利0.23mg可以引起血管平滑肌細胞凋亡數(shù)目增加，同樣Anne Mette[6]等動物模型中發(fā)現(xiàn)卡托普利通過誘導血管平滑肌細胞凋亡而抑制受損傷后血管內(nèi)膜的增生狹窄。這其中的具體機制還不清楚，可能是卡托普利能降低心肌梗死后血管內(nèi)膜AngII的AT1受體的mRNA的表達[31]，從而引起AngII與AT1結(jié)和所致的細胞增生及抗凋亡作用減弱，而與AT2 受體結(jié)合所致的細胞凋亡作用增強的結(jié)果[32-33]。此外Ohwada T[34]等研究發(fā)現(xiàn)對大鼠血管拉傷后給予血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑治療，不但可以明顯增加新生內(nèi)膜ecNOS的表達,同時也可上調(diào)iNOS的表達，導致NO產(chǎn)生過多，而過多NO能通過上調(diào)Fas及Bax的表達，下調(diào)Bcl-2的表達誘導平滑肌細胞凋亡[28]。近來Glzzerman I[7]等在臨床上應用ACEI治療腎移植術(shù)后病人發(fā)生的紅細胞增多癥取得了成功，并闡明其作用機制為ACEI能誘導腎移植術(shù)后病人Fas及其接頭蛋白FADD的mRNA表達增加,上調(diào)其蛋白表達，但對BCL-2.Bcl-xl.Bax,caspase-8.caspase-3的表達無影響，從而通過激活死亡受體途徑誘導祖紅細胞凋亡。由此可見，卡托普利對細胞凋亡所具有促進的作用無疑有利于治療冠狀動脈手術(shù)后的內(nèi)膜增生和再狹窄，同時也為其治療IgA腎病及糖尿病腎病提供了新的理論基礎(chǔ)。問題和展望綜上所述，卡托普利具有抑制和誘導細胞凋亡的雙重作用。但目前的問題是卡托普利為什么會產(chǎn)生兩種截然不同的藥理作用。我們推測這主要取決于細胞類型，卡托普利的劑量以及機體所處病理狀態(tài)等因素，但具體的機制有待進一步研究?？傊ㄍ衅绽深A細胞凋亡的作用已經(jīng)得到了共識：卡托普利通過阻斷AngII與其受體之間的作用，減少氧自由基的產(chǎn)生，調(diào)控NO的合成，干擾Fas和Fasl之間的相互作用來激活或阻斷細胞凋亡程序，從而抑制或促進細胞凋亡。我們有理由相信：通過對卡托普利抗細胞凋亡作用深入研究，無疑為探討充血性心力衰竭，缺血再灌注損傷以及冠狀動脈粥樣硬化及手術(shù)后的再狹窄等帶來突破，并可推動心血管疾病診斷及治療的發(fā)展。參考文獻1 蘇定馮 心血管藥理學(M) 第一版 北京 科學技術(shù)出版社 2001,241-2492 LihlSuzukj J, Bayna E，Zhang FM et，al。Lipopolysaccharide induces apoptosis in adult rat ventricular myocytes via cardiac AT（1） receptors Am J，Physiol heart circ physiol 2002 ; Aug：283（2）：H461-73 Deaso ，Dumont C，Mollereau B et . al. Thiol-mediated inhibition of Fas and CD2 apoptotic singaling in activated human peripheral T cells Int，Immunol，1997.9：117-254 Uhal BD ，Gidea C，Bargout R et al.Captopril inhibits apoptosis in human lung epithelial cells a potential antifibrotic mechanism Am，J，Physoil. 1998：275：1013-75 Buemi M ， Allegra A，Marino D et al .Does captopril have a direct proapoptotic effect Nephron 1999,JAN;81(1):99-1016 Anne Mette ，Holm Claus Bogelund ，Peter Riis Hansen et al. ACE-inhibition promotes apoptosis after balloon injury of rat carotid arteries Cardiovascular Research , 2000;(45):777-7827 Glzzerman I,Patel H, Glicklich D et al .Angiotensin-coverting enzyme inhibition induces death receptor apoptosis pathways in erythoid precursors following renal transplantation. Am J Nephrol.2003 jul-Aug :23(4):195-2018 Constantinescu CS ,Goodman DB, Pauls H et al.Captopril and lisinopril suppress production of interleukin-12 by human peripheral blood mononu clear cells Immol letters 1998,62:25-319 Jay D Captopril and glutathione inhibit the superoxide dismutase activity of Hg(II) Arch Inst Cardiol Mex.1998,68:457-6110 Kerr JF, Wyllie AH ，Currie AR Apoptosis：a basic biological phenomenon with wide-ranging implications in tissue kinetics Br J cancer 1972，26（4）：239-5711 Ashkenazi A ,Dixit VM，Death receptors：singnaling and modulation （J） Science 1998，281（28）：1035-4112 Cain K ,Bratton SB ,Langlais C et al Apaf-1 oligomerizes into biologically active approximately 700-KDa and inactive approximately 1.4-MDa appoptsome complexes （J） Biol，chem ：2000：275（9）：6067-607013 Diep QN, EI Mabrouk, Yue P et al Effect of AT(1) receptor blockade on cardiac apoptosis in angiotensinII induced hypertension.Am J Physiol Heart Circ Physiol ,2002-May;282(5)H1:635-4114Goldenberg I,Grossman E ,Masaki H et al Angiotensin II induced apoptosis in rat cardiomyocytes cuture opossible role of AT1 and AT2 receptors J Hypertension 2001 Sep:19(9):1681-915 Mccarthy NJ ,Benett MR, The regulation of vascular smooth muscle cell apoptosis Cardiovase Res,2000,45(3): 747-75516 Liang xu guo, Hou gui hua,,Pan qi xing Effect of AngiotensinII captopril and losartan on apoptosis in vascular endothelial cells Juournal of ShanDong university ，2002：（40），44：300-30417 梁緒國，潘其星 氯沙坦和卡托普利合用對凋亡基因調(diào)控的影響。國外醫(yī)學：心血管疾病分冊：2003;3:30卷（2）：112-11518 Dimmerler S ,Rippmannn V，Weiland U et al .AngiotensinII induces apoptosis of human endothelial cells protective effect of nitric oxide circ Res 1997，81：970--97619 Oskarsson J, Coppy ,Weiss R et al Antioxidants attenuate myocyte apoptosis in the remote non-infarcted myocardium following large myocardial infarction (J) Cardiovasc Res.2000.45(3):679-68720 Sogaard P,Klausen IC, Rungby J et al Lipoprotein(a) and oxygen free radicals in survivors of acute myocardial infarction effects of captopril Cardiology 1996 .87(1):18-2221 Tamba M ，Torreggiani A. Free radical scavenging and copper chelation：a potentially beneficial action of captopril . Free Radic Res，2000，32（3）：199-21122 胡青松，羅偉 ,程曉署外源羥自由基誘導血管內(nèi)皮細胞凋亡及卡托普利的干預作用.江西醫(yī)藥。2002 ，37：（2）95-9823羅偉，姜醒華,羅偉 羥自由基誘導血管內(nèi)皮細胞.心肌細胞凋亡及卡托普利的干預作用 江西醫(yī)學院學報 2001，41（2）136-13924 Vieira HL,Dorge H The mitochondrion:desive for cell death control ? signaling pathway in aooptosis Cell Death Differ 2000：7（12）：114625 蘇曉華，姜曉林 卡托普利對缺血再灌注心肌線粒體電子-質(zhì)子偶聯(lián)和氧化磷酸化的影響。中國病理生理 1996，12（3）：316-31826 Matsumoto N, Mannabe H ,Ochiai J et al An AT1 receptor antagonist and angiotensin-coverting enzyme inhibitor in hunan aortic endothelial cells throught upregulation of endothelial cell nitric oxide synthase activity . Shock 2003 Jun:19(6):12(3):316-31827 Stefanelli C , Pignati C ,Tantini B et al. Nitric Oxide can function as a killer molecule or antiapoptotic efector in cardiomyocytes Biochim Biophys Acta 1999,1450:406--1328 Fukuo K, Hata S ,Sohara T et al .Nitric oxide induces upregulation of fas and apoptosis in vascular smooth muscle Hypertension, 1996; 27:823-2629 Yoshida H,Zhang JJ ,Chao L et al Kallikrein gene delivery attenuates myocardial infrarction and apoptosis after myocardial ischemia and reperfusion Hypertension 2000;35:25-31 30 Odaka C ,Mizuochi T Angiotensin-converting enzyme inhibitor captopril prevents activation-induced apoptosis by interfering with T Cell activaton signals Clin Exp .2000.Sep;121(3):515-2231 Zhang Gx ,Pu Sy ,Yang Yz et al. Effect of losartan and captopril on expression of cardioc angiotensinII AT1 receptor mRNA in rats following myocardial in farction Zhongguo Yao Li Xue Bao.1997 sep;18(5):431-41232 Yamada T ,Akishita M,Pollman MJ et al .AngiotensinII type 2 receptor mediates vascular smooth muscle cell apoptosis and angiotensinII type 1 receptor action: an in vitro gene transfer study life .Sci 1998:63 :289-29533.Tea BS,Der PB, Sarkissian S et al Proapoptotic and growth-inhibitory role of angiotensinII type 2 receptor in vasucar smooth muscles cell of spontaneously hypertension rats in vivo Hypertension 2000,May,35(5):1069-73 34 Ohwada T, Ishibshi T ,Yaoita H et al .Different contribution of apoptosis to the antiproliferative effects of L-arginine.enalapril and losartan on neointimal growth inhibition after balloon arterial injury Circ J2002 Oct :66(10):965-71立題依據(jù)缺血再灌注損傷不但是心血管疾病中一種常見的病理現(xiàn)象，而且也是導致血管內(nèi)皮細胞過度凋亡的主要原因之一；而細胞凋亡是缺血再灌注損傷的特征之一，細胞凋亡的多少決定了缺血再灌注損傷的輕重。故研究內(nèi)皮細胞細胞在缺血再灌注損傷時凋亡的發(fā)生機制和利用藥物來抑制VEC在缺血再灌注損傷所致的凋亡成為心血管研究領(lǐng)域中的重點課題。 缺血預處理（ischemic preconditionging，IPC）是體內(nèi)最強大的保護機制，是一種多元性細胞防御現(xiàn)象[1]：即預先反復短暫缺血可延緩或減輕組織后續(xù)缺血再灌注損傷的現(xiàn)象。而IPC的保護作用之一便是通過抑制缺血再灌注損傷后缺血區(qū)存活的心肌和血管內(nèi)皮細胞發(fā)生可逆或不可逆壞死或凋亡來體現(xiàn)的[2]。誘導預處理的因素從早期的缺血、缺氧、快速起搏和熱應激到現(xiàn)在的藥物預處理。但由于缺血本身是一種損傷，實施損傷性預處理由于倫理觀念臨床上還難以接受，故誘導預處理的研究已從缺血、生物、物理、化學源性擴展到藥物性預處理（pharmacologic preconditioning）即通過藥物激發(fā)或模擬機體內(nèi)源性物質(zhì)呈現(xiàn)的心臟保護作用。血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑（ACEI）具有藥物預處理作用。目前研究表明， IPC對心臟的保護作用具有雙時相性，即：心臟保護作用在2-3個小時后消失的早期或經(jīng)典預處理；和反復短暫缺血后20-24小時緩慢出現(xiàn)的晚期預處理或延遲性保護作用或第二保護窗口。預處理的早期保護作用時間窗較窄，必須在缺血再灌注損傷前給予，故臨床可操作性不強，相反，晚期預處理作用時間跨度大，在臨床運用時更有可行性和便利性，因此，更具實用價值和開發(fā)意義。而且ACEI通過誘導或增強預處理早期心臟保護作用已有較多研究，而誘導預處理的延遲保護作用的報道不多，而且大多數(shù)ACEI為前體藥，需要在體內(nèi)代謝后才具有生物活性。而卡托普利是非前體藥，具有生物活性，因此在我們的研究中，采用了卡托普利。IPC保護作用不僅存在于器官水平，而且存在于細胞水平；已有研究證明藥物預處理是通過藥物激發(fā)或模擬機體內(nèi)源性物（腺苷，緩激肽，降鈣素基因相關(guān)肽，前列環(huán)素（PGI2），一氧化氮（NO）等），而呈現(xiàn)的保護心肌和血管的作用。其研究方法也是通過模擬IPC而建立起來的，而我們采用模擬IPC而建立起來的前期實驗已經(jīng)證明卡托普利對內(nèi)皮細胞進行晚期預處理后進行缺氧復氧損傷，結(jié)果發(fā)現(xiàn)細胞的凋亡現(xiàn)象明顯減輕，從而證明卡托普利對缺氧復氧損傷導致的內(nèi)皮細胞凋亡具有延遲保護效應，使細胞凋亡減少，并且在本實驗所規(guī)定的濃度范圍內(nèi)，隨著卡托普利濃度的增加此保護作用漸增強。但應用HOE140阻斷劑、PKC阻斷劑、NOS阻斷劑和NF-kB阻斷劑，分別與卡托盡管作普利共同孵育細胞,再對內(nèi)皮細胞行H/R損傷，可見卡托普利對H/R損傷導致內(nèi)皮細胞凋亡的晚期保護效應部分消失。證明卡托普利是通過激活緩激肽B2受體、PKC途徑、NOS合成以及核因子的轉(zhuǎn)錄過程，保護內(nèi)皮細胞，抑制細胞凋亡的，但其具體作用靶點仍有待于進一步的研究。半胱氨酸蛋白酶（Caspase）家族目前被認為是與凋亡最為密切相關(guān)的一類蛋白酶，凋亡的發(fā)生是細胞中Caspase家族凋亡蛋白特異性活化的結(jié)果。其中Caspase-3、Caspase- 8、Caspase-9在細胞凋亡經(jīng)典途徑中的重要凋亡蛋白，在凋亡過程中起著關(guān)鍵作用，而目前對卡托普利預處理與Caspase蛋白表達的關(guān)系研究在國內(nèi)外報道均未多見，故本實驗根據(jù)以往的研究結(jié)果，采用免疫組化的方法來檢測Caspase-3、Caspase- 8、Caspase-9的蛋白表達來探討以下問題：1 缺氧/復氧損傷誘導血管內(nèi)皮細胞凋亡途徑的研究。2.ACEI晚期預適應抑制缺氧復氧誘導血管內(nèi)皮細胞凋亡的作用靶點。以進一步明確缺血再灌注損傷和ACEI晚期預適應抑制細胞凋亡的的相關(guān)機制，為臨床應用提供新得理論基礎(chǔ)和治療靶點。內(nèi) 容 提 要缺血再灌注損傷可以導致內(nèi)皮細胞結(jié)構(gòu)改變和功能失調(diào)，進而引起細胞發(fā)生一系列變化，例如細胞內(nèi)鈣離子超載、脂質(zhì)過氧化反應增加、大量自由基產(chǎn)生、細胞膜通透性增強、蛋白含量降低等變化，最終引起細胞死亡或凋亡。自從1986年Murry等首次發(fā)現(xiàn)預處理現(xiàn)象至今，缺血預適應（IPC）的機制尚不十分明確，但多年的研究明確證實，IPC是最強大的內(nèi)源性保護機制，其心臟保護作用主要表現(xiàn)在限制心梗范圍，減少惡性心律失常的發(fā)生和改善心功能等。藥物預處理研究的發(fā)展，避免了缺血的損傷，更符合醫(yī)學論理學。近年來發(fā)現(xiàn)，IPC及其藥物預適應對缺氧再灌注損傷的血管床亦有保護作用。但無論是缺血還是藥物預適應，特別是晚期預適應，其研究的重點多集中于對心肌細胞的保護，而對內(nèi)皮細胞與缺血再灌注損傷的研究、預適應特別是晚期預適應保護內(nèi)皮細胞免受缺血再灌注損傷的研究還不多見，僅少數(shù)實驗涉及此方面的研究，相關(guān)文獻報道較少用。在實驗中，我們通過建立血管內(nèi)皮細胞缺血再灌注（缺氧復氧）損傷模型,以探討ACEI預適應對血管內(nèi)皮的延遲保護作用及其機制。實驗研究結(jié)果顯示：1. 缺氧復氧損傷引起血管內(nèi)皮細胞凋亡的病理過程中，caspase-3,9被激活，并且隨著復氧時間的延長，caspase-3，9表達逐漸增加，提示caspase-3,9參與了缺氧復氧損傷誘導血管內(nèi)皮細胞凋亡的病理過程；同時caspase-8表達在這個過程中無明顯變化，因而我們可以從中推測缺氧復氧損傷導致血管內(nèi)皮細胞凋亡主要是通過線立體途徑進行的。2. 卡托普利預處理組的Caspase表達變化與缺氧/復氧組相似，但明顯下降,有此可見，卡托普利預處理可以通過影響緩激肽B2受體、一氧化氮產(chǎn)生等多種途徑來降低caspase-3,9的表達來抑制細胞凋亡而發(fā)揮血管內(nèi)皮的保護作用, 且此保護作用具有劑量依賴性。由此可見，卡托普利預處理對血管內(nèi)皮的保護作用涉及多種機制。這對于維持血管內(nèi)皮細胞的屏障功能和內(nèi)分泌功能，減輕缺血后的炎癥反應，維持血流穩(wěn)定和血管的緊張性調(diào)節(jié)具有重要意義。本研究將進一步闡述卡托普利的作用機制，為其臨床應用提供新的作用空間。關(guān)鍵詞：細胞凋亡 卡托普利 Caspase-3,8,9 缺血再灌注損傷第一部分：缺氧/復氧損傷誘導血管內(nèi)皮細胞凋亡途徑的研究前言細胞凋亡是細胞的程序化死亡，是由一系列高度調(diào)控的半胱氨酸蛋白酶（caspase）級聯(lián)反應（cascade）事件的結(jié)果，而caspase-3又被證實處于該級聯(lián)反映的下游，是凋亡的真正執(zhí)行者； caspase-8,9又分別做為細胞凋亡的兩條主要途徑中caspase-3的激活劑，故三者在細胞凋亡中起著重要作用。而缺血在灌注損傷不但是心血管疾病中一種常見的病理現(xiàn)象，而且也是導致血管內(nèi)皮細胞凋亡的主要原因之一，目前關(guān)于缺血再灌注損傷誘導細胞凋亡的研究多集中于神經(jīng)元細胞和心肌細胞，對血管內(nèi)皮細胞的凋亡機制了解不是很多。而且，缺血再灌注損傷可引起細胞凋亡已在大量實驗中得以證實，故本實驗對此不在重復，重點是通過對培養(yǎng)的人臍靜脈內(nèi)皮細胞進行缺氧/復氧來模擬缺血再灌注損傷這一病理過程，并采用免疫組化的方法檢測caspase-3,8,9的表達，來進一步探討和闡明缺血再灌注損傷導致細胞凋的相關(guān)機制和caspase3,8,9在細胞凋亡中所起的作用。1 材料與方法1.1實驗材料1.1.1實驗儀器 二氧化碳培養(yǎng)箱(RAK 日本) 倒置相差顯微鏡(OLYMPUS公司) 恒溫水浴箱(H2S-H 哈爾濱) 加樣器(Labsystem芬蘭)顯微鏡自動暴光系統(tǒng)（（OLYMPUS pm20）超凈工作臺（SW-CT-EFD蘇州）低溫臺式離心機（AERMLE Z383K 德國） 1.1.2實驗藥品與試劑人臍靜脈內(nèi)皮細胞株（購置中國科學院上海細胞庫）caspase-3,8,9單克隆鼠抗人抗體（Santa Cruz）辣根過氧化物酶兔抗鼠抗體（Santa Cruz）胰蛋白酶(trypsin)購自Difco公司.高壓氮氣一瓶（上海比歐西氣體工業(yè)有限公司）胎牛血清和DMEM合成培養(yǎng)基購自Gibco公司。將干粉型DMEM培養(yǎng)基10g溶于三蒸水1000ml，在磁力攪拌器上混勻，過濾除菌，分裝于250ml鹽水瓶中4C保存。胎牛血清首次應用時先56℃滅活30min。用時現(xiàn)配制成含15%胎牛血清的DMEM：取胎牛血清15ml, HEPES（1mmol/L）1ml，L谷氨酰胺（0.2mmol/L）1ml, 抗菌素液(青霉素10,000U/ml鏈霉素10,000g/ml)1ml, 加入DMEM82ml,然后用7.5%NaHCO3調(diào)PH至7.4。配制無血清DMEM：DMEM 96ml，加入HEPES、L谷氨酰胺、抗菌素液各1ml，然后用7.5%NaHCO3調(diào)PH至7.4。HanK’s緩沖液：NaCl 8.0g，KCl 0.4g，KH2PO4 0.06g，Na2HPO4·12H2O 0.13g，Na2CO3 0.35g，CaCl2 0.14g，MgSO4·7H2O 0.2g，葡萄糖·H2O 10.9g，加三蒸水至1000ml，混勻后用NaHCO3調(diào)PH至7.4，過濾除菌，250ml瓶分裝，4℃保存。D-HanK’s緩沖液：NaCl 8.0g，KCl 0.4g，KH2PO4 0.06g，Na2HPO4·12H2O 0.13g，Na2CO3 0.35g，加三蒸水至1000ml，混勻后用NaHCO3調(diào)PH至7.4,高壓除菌，250ml瓶分裝，4℃保存。PBS緩沖液: NaCl 8.0g，KCl 0.2g，KH2PO4 0.2g，Na2HPO4·12H2O 3.5g,加三蒸水至1000ml，混勻后用NaHCO3調(diào)PH至7.4，過濾除菌，250ml瓶分裝，4℃保存。缺氧液：Na2HPO4:0.9mmol/L；NaHCO3:6.0mmol/L ；CaCl2：1.8mmol/L；MgSO4:1.2mmol/L;乳酸鈉:40mmol/L;HEPES:10mmol/L; Nacl:98.5mmol;KCl:10.00mmol/L加三蒸水至1000ml，混勻后用NaHCO3調(diào)PH至7.4，過濾除菌，250ml瓶分裝，4℃保存。復氧液：Na2HPO4:0.9mmol/L；NaHCO3 ：20.0mmol/L ；CaCl2 ：1.8mmol/L；MgSO4:1.2mmol/L；glucose:55mmol/L；HEPES:10mmol/L; Nacl:129.5mmol；KCl:5.0 mmol/L加三蒸水至1000ml，混勻后用NaHCO3調(diào)PH至7.4，過濾除菌，250ml瓶分裝，4℃保存。1.2 實驗方法1.2.1人臍靜脈內(nèi)皮細胞的培養(yǎng)（1）體外培養(yǎng)的人臍靜脈內(nèi)皮細胞形態(tài)呈“鵝卵石樣”鑲嵌排列，細胞長滿后呈接觸抑制現(xiàn)象。（2）2-3d換液一次。換液時將原培養(yǎng)液棄掉1/2-2/3，然后加入新鮮的培養(yǎng)液至原來的量。待細胞長至融合狀態(tài)后，即可傳代。（3）原代培養(yǎng)的細胞長至融合狀態(tài)后，棄培養(yǎng)液，用預溫的D-Hank’s液清洗2次。加入0.125%胰蛋白酶-0.01%EDTA混合消化液，正好形成一淺層液面將細胞覆蓋，室溫（20-25℃）下消化1-2min。（4）鏡下見細胞稍收縮變圓、細胞間隙增寬后，立即翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶，棄酶液?？稍儆肈-Hanks液輕輕洗1次。加入IMDM培養(yǎng)液（pH7.2、100IU/ml青霉素、100g/ml鏈霉素）和10%胎牛血清。（5）用彎頭吸管吸取培養(yǎng)液，輕輕將細胞吹打下來。調(diào)整細胞密度至大約1.5×105個/ml。按實驗需要接種到新的培養(yǎng)瓶或其他培養(yǎng)皿中。一般按1：2或1：3的比例傳代（即1瓶傳2-3瓶）。（6）內(nèi)皮細胞多次傳代后，其形態(tài)和生物學特性會有所改變，故不宜做長期傳代培養(yǎng)。如實驗需要可重復從原代建立培養(yǎng)。因此，一般不做冷凍和復蘇處理。1.2.2 臺盼藍染色細胞記數(shù) 細胞記數(shù)對于決定植入的細胞濃度和數(shù)量以及了解細胞存活率和增殖度都是極為重要的。首先取待測的細胞懸液0.1ml加D-Hank’s0.8ml及0.3%臺盼藍0.1ml（死細胞著色），混合后滴入血球記數(shù)盤內(nèi)，按白細胞記數(shù)法，于低倍鏡下計數(shù)4角的4個大格內(nèi)的活細胞數(shù)（透明未著色者），然后按下式記數(shù)：細胞濃度（細胞數(shù)/ml）=（4個大格內(nèi)的活細胞數(shù)/4）×104×稀釋倍數(shù)（10）細胞存活率=活細胞數(shù)/（活細胞數(shù)+死細胞數(shù)）×100%1.2.3缺氧復氧模型的建立取培養(yǎng)至第3代的人臍靜脈內(nèi)皮細胞用缺氧液換液，95%氮氣、37℃培養(yǎng)不同時間后，再以復氧液全量換液，并恢復5%CO2氣體環(huán)境正常培養(yǎng)，建立缺氧復氧模型。1.2.4實驗分組與方案 實驗隨機分兩組：（1）對照組（C）：細胞置IMDM培養(yǎng)基中于5%CO2、370℃飽和濕度培養(yǎng)箱培養(yǎng) （2）缺氧復氧組（H/R）：細胞于缺氧液、100%氮氣、37℃條件下培養(yǎng)2小時后，全量換以復氧液，并恢復5%CO2氣體環(huán)境分別培養(yǎng)1小時，2小時，3小時，4小時。1.3 Caspase—3，8，9表達測定：采用免疫組化染色的方法：收集以上各組細胞，于4℃多聚甲醛固定后過夜，再用0.5%H2O2—甲醇液處理30分鐘（封閉細胞內(nèi)源性過氧化物），再浸入到PBS中洗3×5分鐘，滴加5%—10%的正常動物血清，室溫，放濕盒中封閉30分鐘，滴加一抗，濕盒內(nèi)4℃過夜，再浸入到PBS中洗3×5分鐘，滴加二抗，37℃，30分鐘，浸入到PBS中洗3×5分鐘，加入避光顯色5—10分鐘（室溫），光鏡下控制反應強度（棕色），浸入到PBS中洗3×5分鐘，終止反應，經(jīng)80%，90%，2×100%乙醇溶液脫水，二甲苯透明，每步1分鐘，室溫放置數(shù)分鐘，使二甲苯完全蒸發(fā)掉，最后滴加1滴封片液。1.4 細胞記數(shù)：在培養(yǎng)孔邊緣統(tǒng)計學分析和中心之間的位置隨機選取4個區(qū)域進行細胞記數(shù)并取平均值，每個區(qū)域記數(shù)約200個細胞，每組有4個平行孔，計算陽性細胞占細胞總數(shù)的百分比.1.5統(tǒng)計學分析各種計量數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標準差表示，各組數(shù)據(jù)間顯著性檢驗采用t檢驗，多個樣本均數(shù)比較及兩兩比較采用ANOVA，統(tǒng)計學分析應用SPSS軟件包。P<0.05為差異有顯著性。2結(jié)果2.1對照組的Caspase蛋白表達：對照組的細胞染色均很微弱，說明正常條件下Caspase-3,8,9的蛋白基本無明顯表達，表明Caspase-3,8,9在正常條件下活性低下。2.2缺氧復氧組的Caspase蛋白表達：與對照組相比,缺氧/復氧組中檢測Caspase-3,9蛋白表達的細胞的染色明顯，各組相比P<0.05差異有統(tǒng)計學意義這說明缺氧/復氧損傷使血管內(nèi)皮細胞的Caspase-3,9蛋白表達明顯增加，；而檢測Caspase-8蛋白表達的細胞染色無明顯染色，各組相比P>0.05差異無統(tǒng)計學意義，這說明Caspase-8在缺氧復氧損傷中沒有明顯表達，即沒有參與這一病理過程。2.3Caspase蛋白表達的時間依賴性：缺氧復氧組的血管內(nèi)皮細胞Caspase-3,9的表達隨著復氧時間的延長而進一步增加直到復氧四小時而達到頂峰。（表1）（附圖1）Table1 Changes of caspase-3.8.9 expression on HUVEC induced by hypoxia/reoxygenation groupCaspase expression positive cells % Caspase-3 casepase-8 casepase-9Control group 5.6±1.2* 3.3±1.4 6.4±2.2*hypoxia/reoxygenation1.0h 12.8±2.4* 3.2±2.2 22.6±2.4*hypoxia/reoxygenation2.0h 20.5±3.2* 3.6±2.6 32.8±1.8*hypoxia/reoxygenation3.0h 38.8±2.2* 3.5±2.1 42.2±3.2*hypoxia/reoxygenation4.0h 47.2±2.6* 3..8±1.6 52.8±2.6*The expression of caspase-3,8,9 were detected by immunocytochemistry. the Caspase-3、9 were activated in HUVEC during hypoxia /reoxygenation and expression of caspase-3,9 were significantly increased fol lowed the time of reoxygenation extending;but expression of caspase-8 have no changes in HUVEC during hypoxia/ reoxyge nation.3.討論缺血和缺氧有著極其相似的病理改變和發(fā)病機制，故設(shè)計利用培養(yǎng)的人臍靜脈內(nèi)皮細胞的缺氧復氧模型來模擬缺血再灌注損傷模型，旨在研究缺血再灌注損傷導致細胞凋亡的可能機制及Caspase家族相關(guān)的蛋白酶的表達變化。為了更好的模擬在體時細胞的缺血再灌注狀態(tài)，在缺氧時我們采用缺氧液培養(yǎng)細胞，除造成缺氧外，同時限制糖，鈣及液體量，而在復氧時則用含糖，鈣的復氧液，并給予充分的氧，以滿足再灌注的條件。在本實驗中，我們發(fā)現(xiàn)在對照組的HUVEC的Caspase-9僅低水平表達，但實驗組在缺氧兩小時后再進行復氧的過程中，在復氧早期Caspase—9，表達即開始增加，并隨著復氧的時間的延長而逐漸增加，在復氧四小時達到頂峰。這無疑提示Caspase—9在缺氧/復氧誘導HUVEC凋亡這一病理過程中被激活并參與了這一病理過程。細胞凋亡是由于細胞程內(nèi)外環(huán)境變化或死亡信號觸發(fā)以及在基因調(diào)控下所引起細胞主動死亡的過程，這一過程一般要經(jīng)歷啟始階段、效應階段和降解階段（Initiation phase、Effect phase and Degradation phase）三個階段[3]。啟始階段時，細胞受到來自外界的各類凋亡信號的刺激以引發(fā)細胞內(nèi)一系列生化反應；效應階段時，細胞內(nèi)進行各種生化反應而形成細胞凋亡的一條或數(shù)條信號傳導通路，其中包括必須的四大關(guān)鍵元件：線粒體，Caspase ，bcl-2s和Apaf-1。最終細胞進入降解階段時，多種水解酶（包括特異性蛋白酶Caspase 和核酸酶）被活化，細胞內(nèi)表現(xiàn)為DNA的降解，細胞質(zhì)和細胞核濃縮，細胞體積縮小，質(zhì)膜發(fā)泡，最終細胞裂解，凋亡小體形成并被周邊吞噬細胞吞噬降解。由此可見，Caspase家族在細胞凋亡中發(fā)揮著極為重要的作用。Caspase家族的分子量在30-50KD之間，包括三個結(jié)構(gòu)域：氨基端的原域、大亞單位（約20KD）、和小亞單位（約10KD）。根據(jù)它們之間大小亞單位序列的同源性以及功能，可分為三組[4]：（1）細胞因子處理組：Caspase-1、-4、-5、-11、-12、-13和-14；（2）凋亡起始組：Caspase-2、-8、-9和-10（3）：凋亡效應組：Caspase-3、-6和-7。細胞因子處理組和起始組Caspase酶原都含有較長的原域，長原域中包含有死亡效應域（DED）或Caspase募集域（CARD）。DED和CARD的結(jié)構(gòu)與死亡域(DD)相似，都屬于死亡域超家族。這些區(qū)域通過蛋白-蛋白的相互作用從而在Caspase酶原的激活過程中發(fā)揮重要作用。相比之下，效應組Caspase的原域很短，不可能通過這種方式激活。除此之外，Caspase還具備以下特點（1）：它是一種半胱氨酸蛋白酶，用半胱氨酸作為裂解底物的親核集團（2）：其催化活性對底物的天冬氨酸有特異的要求，既催化時使底物的天冬氨酸殘基羧基端的肽鍵斷裂（3）：Caspase以活性很低的酶原形式合成，通過蛋白酶水解去處氨基端的一段序列而被激活。（4）：活化的Caspase能夠特異性地水解一套底物，從而導致細胞凋亡，此過程為不可逆反應。（5）：正常情況下，細胞內(nèi)Caspase與其抑制劑總是共存的，以免Caspase酶原被意外激活，對正常細胞造成損傷。正是這種Caspase家族組成的復雜性和獨特的生物學特性才決定了不同的細胞含有不同的Caspase群體，不同的刺激激活不同的細胞凋亡信號傳導途徑，由不同的Caspase參與信號的級聯(lián)放大反應，故發(fā)生細胞凋亡的機制也不盡相同。在本實驗中，我們還發(fā)現(xiàn)在復氧早期Caspase—3蛋白表達即開始增加，并隨著復氧的時間的延長而逐漸增加，在復氧四小時達到頂峰。這無疑提示Caspase—3在缺氧/復氧誘導HUVEC凋亡這一病理過程中被激活并參與了這一病理過程。這與[MatsushitaH] [5]所進行的缺氧誘導內(nèi)皮細胞凋亡時實驗結(jié)果相一致。Caspase-3基因（CASP-3）最初在人類Jurkat-T淋巴細胞中被克隆出的，該基因編碼一個分子量為32KD的半胱氨酸蛋白酶CPP32，其活性中心和結(jié)合底物相關(guān)的保守氨基酸序列均與白細胞介素—Iβ轉(zhuǎn)化酶（IEC）一致。其后，等研究發(fā)現(xiàn)CPP32酶原含有凋亡素，它由分子量為17KD和12KD的大小2個亞基組成，[Nicholson]等把它命名為Caspase-3[6]。在Caspase-3酶原中存在一安全扣調(diào)解三肽，由“Asp-Asp-Asp”組成，位于大小亞基結(jié)合處可變形的環(huán)區(qū)中，凋亡發(fā)生時該三肽殘基在胞漿內(nèi)被酸化裂解，在Caspase-3的觸發(fā)活化是起關(guān)鍵作用，因而它可能是整個凋亡級聯(lián)反應的一個關(guān)鍵調(diào)節(jié)點[7] 。正常情況下，Caspase-3是以休眠狀態(tài)的酶原形式存在于正常細胞中，酶原的N端有一前區(qū)（prodomain），與Caspase-8、9等起始型Caspase相比，其前區(qū)較短，不含有DED，必須在起始型Caspase被激活后才能進一步被激活[8]。Caspase-3的激活主要是通過兩條細胞凋亡途徑進行的：1死亡受體途徑[9]: 死亡受體屬于腫瘤因子受體(TNFR)超家族,包括Fas, TNFR1,DR3 ,DR4和DR5,在胞內(nèi)部分含有一個死亡域(DD),以此招募下游的凋亡蛋白。Fas配體是一個同源三聚體，每個三聚體分子結(jié)合3個Fas分子。一旦與三聚體的配體相結(jié)合，F(xiàn)as通過胞內(nèi)段的DD和FADD羧基端的DD之間的相互作用，募集胞質(zhì)中的銜接蛋白FADD。FADD氨基端含有DED，此DED和Caspase-8原域的DED相互作用，把Caspase-8募集到Fas區(qū)域。Fas、FADD和Caspase-8形成了死亡誘導信號復合體（DISC）。Caspase-8酶原有弱的蛋白水解活性，在DISC中Caspase-8由于寡聚化水解活性增強，而自我剪切活化 ?；罨腃aspase-8釋放到細胞質(zhì)中即激活Caspase—3；2：線粒體通路[10]：各種促凋亡信號如DNA損傷、生長因子去除等誘導線粒體釋放細胞色素C。在ATP/dATP存在的情況下，細胞色素C結(jié)合到Apaf-1的WD40重復區(qū)域，促使Apaf-1寡聚化，形成Apaf-1-細胞上色素C多聚復合體。此復合體通過Apaf-1的氨基端的CARD與Caspase-9原域的CARD之間的蛋白—蛋白相互作用，以1：1比例募集胞質(zhì)的Caspase—9。Caspase—9酶原之間因相互靠近自我剪切而活化。Caspase—9作為起始半胱氨酸蛋白酶激活下游的Caspase—3。Caspase—3激活時在Asp（pl）-x位置切開，形成大小亞基（α和β），同時去掉其N端的前區(qū)，進而α與β結(jié)合形成異二聚體（17KD-12KD）[11]，酶的兩個活性位點位于大小亞基的結(jié)合部，異二聚體還將進一步通過次級鍵形成四級結(jié)構(gòu)（α/β）2發(fā)揮作用。Caspase酶原被剪切而發(fā)揮作用時，其辨認序列從N端到切割位點至少要4個氨基酸，而且P1位點必須是Asp（D）。一旦Caspase—3被激活，其本身至少從三個方面導致細胞凋亡[11]：（1）分解凋亡保護蛋白，如凋亡抑制性蛋白bcl-2家族（2）直接解聚細胞結(jié)構(gòu)，如分解細胞骨架蛋白（α-spectrin, β-spectrin,actin,tau蛋白等）和調(diào)節(jié)細胞骨架的蛋白gelsolin。（3）使細胞內(nèi)參與DNA復制和修復的蛋白酶失活或下調(diào)，而且激活其他的Caspase并且放大Caspase級聯(lián)反應，最終導致細胞凋亡。同時我們還從實驗中發(fā)現(xiàn)Caspase—8的表達在缺氧/復氧誘導細胞凋亡的整個過程中，無明顯變化，這說明Caspase-3的激活主要是通過線粒體途徑由Caspase-9激活的，而不是通過細胞的死亡受體途徑由Caspase-8激活的。這也進一步說明缺氧/復氧導致內(nèi)皮細胞受損時，氧自由基大量產(chǎn)生和細胞內(nèi)鈣超載等多種機制引起線粒體的跨膜電位崩解，激發(fā)了細胞凋亡的線粒體途徑而導致細胞凋亡。4.結(jié)論 在缺氧復氧損傷誘導HUVEC凋亡的過程中， Caspase-3，-9蛋白表達明顯增加，并隨著復氧的時間的延長而逐漸增加，在復氧四小時達到頂峰。這說明Caspase-3， Caspase—9參與了缺氧/復氧誘導HUVEC凋亡這一病理；同時Caspase—8的蛋白表達在缺氧/復氧誘導細胞凋亡的整個過程中，無明顯變化，從中我們可以推測缺氧/復氧誘導血管內(nèi)皮細胞凋亡主要是通過線粒體途徑進行的。第二部分 ACEI預適應對缺氧復氧誘導血管內(nèi)皮細胞凋亡時caspase-3,8,9的影響及機制前言 IPC作為體內(nèi)最強大的內(nèi)源性保護機制，在缺血再灌注損傷中的作用已是不爭的事實，IPC的保護作用不僅存在于器官水平，而且存在于細胞水平；不僅可以保護心肌細胞，還可以保護內(nèi)皮細胞。然而，缺血本身是一種損傷，實施損傷性預處理由于倫理觀念臨床上還難以接受，故藥物性預處理具有重要的研究價值?？ㄍ衅绽堑谝粋€口服有效的血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑，自從1981年由美國FDA批準用于治療高血壓以來，卡托普利在治療充血性心力衰竭，心肌梗死后的心室重構(gòu)和糖尿病腎病中取得了良好的療效。它在血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑中應用范圍最廣[13]。隨著相關(guān)基礎(chǔ)科學的迅猛發(fā)展和對卡托普利藥理作用研究的深入，近來人們在大量的動物和臨床實驗中發(fā)現(xiàn)卡托普利具有藥物預處理的作用。 缺血再灌注損傷不但是心血管疾病中一種常見的病理現(xiàn)象，而且也是導致血管內(nèi)皮細胞過度凋亡的主要原因之一，這已在大量的實驗中得以證實，但對其發(fā)生機制的闡明還缺乏明確闡述。而且關(guān)于缺血及再灌注時細胞凋亡機制的研究,目前主要集中在神經(jīng)細胞和心肌細胞,對VEC的研究較少。此外血管內(nèi)皮細胞作為一個具有多種生物活性的器官，具有重要的生理功能，內(nèi)皮細胞凋亡過度既是內(nèi)皮細胞功能失調(diào)的始動環(huán)節(jié)，也是冠心病發(fā)生和發(fā)展的細胞學基礎(chǔ)，也是不穩(wěn)定型心絞痛、急性心肌梗死等急性心臟事件的促發(fā)環(huán)節(jié)，而且還能抑制心臟急性缺血后的血管再生，妨礙其功能的恢復。故研究缺血再灌注損傷導致VEC發(fā)生凋亡的機制,明確有效的阻斷位點并加以阻斷,對保護VEC,治療缺血缺氧性疾病有重要的理論和現(xiàn)實意義。本實驗通過建立血管內(nèi)皮細胞缺血再灌注（缺氧復氧）損傷模型,探討ACEI預適應對血管內(nèi)皮的延遲保護作用機制，為其抗缺血再灌注損傷作用提供實驗依據(jù)和理論基礎(chǔ)。1 材料與方法1.1實驗材料1.1.1實驗儀器 二氧化碳培養(yǎng)箱(RAK 日本) 倒置相差顯微鏡(OLYMPUS公司) 恒溫水浴箱(H2S-H 哈爾濱) 加樣器(Labsystem芬蘭)顯微鏡自動暴光系統(tǒng)（（OLYMPUS pm20）超凈工作臺（SW-CT-EFD蘇州）低溫臺式離心機（AERMLE Z383K 德國） 1.1.2實驗藥品與試劑人臍靜脈內(nèi)皮細胞株（購置中國科學院上海細胞庫）caspase-3,9單克隆鼠抗人抗體（Santa Cruz）辣根過氧化物酶兔抗鼠抗體（Santa Cruz）胰蛋白酶(trypsin)購自（Difco公司.）卡托普利純品（中美上海施貴寶公司饋贈）高壓氮氣一瓶（上海比歐西氣體工業(yè)有限公司）胎牛血清和DMEM合成培養(yǎng)基購自(Sigma Chemical Co.USA)HanK’s緩沖液，D-HanK’s緩沖液PBS緩沖液缺氧液，復氧液1.2 實驗方法1.2.1人臍靜脈內(nèi)皮細胞的培養(yǎng)（1）體外培養(yǎng)的人臍靜脈內(nèi)皮細胞形態(tài)呈“鵝卵石樣”鑲嵌排列，細胞長滿后呈接觸抑制現(xiàn)象。（2）2-3d換液一次。換液時將原培養(yǎng)液棄掉1/2-2/3，然后加入新鮮的培養(yǎng)液至原來的量。待細胞長至融合狀態(tài)后，即可傳代。（3）原代培養(yǎng)的細胞長至融合狀態(tài)后，棄培養(yǎng)液，用預溫的D-Hank’s液清洗2次。加入0.125%胰蛋白酶-0.01%EDTA混合消化液，正好形成一淺層液面將細胞覆蓋，室溫（20-25℃）下消化1-2min。（4）鏡下見細胞稍收縮變圓、細胞間隙增寬后，立即翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶，棄酶液。可再用D-Hanks液輕輕洗1次。加入IMDM培養(yǎng)液（pH7.2、100IU/ml青霉素、100g/ml鏈霉素）和10%胎牛血清。（5）用彎頭吸管吸取培養(yǎng)液，輕輕將細胞吹打下來。調(diào)整細胞密度至大約1.5×105個/ml。按實驗需要接種到新的培養(yǎng)瓶或其他培養(yǎng)皿中。一般按1：2或1：3的比例傳代（即1瓶傳2-3瓶）。（6）內(nèi)皮細胞多次傳代后，其形態(tài)和生物學特性會有所改變，故不宜做長期傳代培養(yǎng)。如實驗需要可重復從原代建立培養(yǎng)。因此，一般不做冷凍和復蘇處理。1.2.2 臺盼藍染色細胞記數(shù) 細胞記數(shù)對于決定植入的細胞濃度和數(shù)量以及了解細胞存活率和增殖度都是極為重要的。 首先取待測的細胞懸液0.1ml加D-Hank’s0.8ml及0.3%臺盼藍0.1ml（死細胞著色），混合后滴入血球記數(shù)盤內(nèi)，按白細胞記數(shù)法，于低倍鏡下計數(shù)4角的4個大格內(nèi)的活細胞數(shù)（透明未著色者），然后按下式記數(shù)：細胞濃度（細胞數(shù)/ml）=（4個大格內(nèi)的活細胞數(shù)/4）×104×稀釋倍數(shù)（10）細胞存活率=活細胞數(shù)/（活細胞數(shù)+死細胞數(shù)）×100%1.2.3缺氧復氧模型的建立取培養(yǎng)至第3代的人臍靜脈內(nèi)皮細胞用缺氧液換液，95%氮氣、37℃培養(yǎng)不同時間后，再以復氧液全量換液，并恢復5%CO2氣體環(huán)境正常培養(yǎng)，建立缺氧復氧模型。1.2.4實驗分組與方案 實驗隨機分三組：（1）對照組（C）：細胞于IMDM培養(yǎng)基中于5%CO2、37℃飽和濕度培養(yǎng)箱培養(yǎng) （2）缺氧復氧組（H2/R4）：細胞于缺氧液、100%氮氣、37℃條件下培養(yǎng)2小時后，全量換以復氧液，并恢復5%CO2氣體環(huán)境培養(yǎng)4小時。（4）卡托普利預處理組（CAP）：不同濃度的卡托普利（10-2、10-3、10-4mol/L）預處理24小時后，對EC行缺氧2小時復氧4小時（H2/R4）方案。1.3 Caspase—3，9蛋白表達測定：采用免疫組化染色的方法：收集以上各組細胞，于4℃多聚甲醛固定后過夜，再用0.5%H2O2—甲醇液處理30分鐘（封閉細胞內(nèi)源性過氧化物），再浸入到PBS中洗3×5分鐘，滴加5%—10%的正常動物血清，室溫，放濕盒中封閉30分鐘，滴加一抗，濕盒內(nèi)4℃過夜，再浸入到PBS中洗3×5分鐘，滴加二抗，37℃，30分鐘，浸入到PBS中洗3×5分鐘，加入避光顯色5—10分鐘（室溫），光鏡下控制反應強度（棕色），浸入到PBS中洗3×5分鐘，終止反應，經(jīng)80%，90%，2×100%乙醇溶液脫水，二甲苯透明，每步1分鐘，室溫放置數(shù)分鐘，使二甲苯完全蒸發(fā)掉，最后滴加1滴封片液。1.4 細胞記數(shù)在培養(yǎng)孔邊緣統(tǒng)計學分析和中心之間的位置隨機選取4個區(qū)域進行細胞記數(shù)并取平均值，每個區(qū)域記數(shù)約200個細胞，每組有4個平行孔，計算陽性細胞占細胞總數(shù)的百分比.1.5統(tǒng)計學分析各種計量數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標準差表示，各組數(shù)據(jù)間顯著性檢驗采用t檢驗，多個樣本均數(shù)比較及兩兩比較采用ANOVA，統(tǒng)計學分析應用SPSS軟件包。P<0.05為差異有顯著性。2. 結(jié)果2.1卡托普利最適濃度的篩選待細胞生長達80%匯合以后,各組分別加入10-1mol/l，10-2mol/l、10-3 mol/l、10-4 mol/l 、10-5 mol/l 、10-6 mol/l 作用24小時,觀察各組細胞的生長狀況。收集全部的貼壁和漂浮細胞,用臺盼藍染色后在細胞計數(shù)板上進行活細胞計數(shù)?；罴毎蚱浼毎さ耐暾远鴮ε_盼藍拒染,死細胞被臺盼藍染成藍色?；罴毎俜謹?shù)=未著色細胞數(shù)/細胞總數(shù)(著色細胞數(shù)+未著色細胞數(shù))。以細胞生長不受影響而卡托普利濃度達最高時的濃度作為實驗最大濃度。2.2 Caspase蛋白表達的檢測結(jié)果2.2.1對照組的Caspase蛋白表達：對照組的細胞染色均很微弱，說明正常條件下內(nèi)皮細胞Caspase-3,9的蛋白基本無明顯表達，同時也說明Caspase-3,9在正常條件下活性低下。2.2.2卡托普利預處理組的Caspase蛋白表達：與正常對照組細胞微弱的染色相比, 卡托普利預處理組的細胞細胞染色有所增加，與缺氧/復氧組的細胞染色相比則明顯減少，各組細胞染色相比P<0.05，差異有統(tǒng)計學意義。這說明缺氧/復氧損傷使血管內(nèi)皮細胞的Caspase-3,9蛋白表達明顯增加，而卡托普利預處理可以明顯降低凋亡細胞的Caspase-3,9蛋白表達。2.2.3 Caspase蛋白表達的時間依賴性：卡托普利預處理組的Caspase3、9的表達且隨著卡托普利濃度的增加而逐漸降低，這種抑制作用與卡托普利的濃度具有量-效關(guān)系。并隨著卡托普利濃度的增加而Caspase-3,9的表達降低越明顯，三者相比P<0.05，差異有統(tǒng)計學意義.。（表2）（附圖2）Table2 Effect of on caspase-3.8.9 expression on HUVEC induced by hypoxia/reoxygenation and preconditioning with captoprilgroup Caspase expression positive cells % Caspase-3 Casepase-9 Control group 4.6±1.9* 5.2±2.8* H2/R4 47.8±2.4* 62.6±2.4* H2/R4 +capotril(10-4) mmol/L 39.2±2.2* 48.6±3.8* H2/R4 +capotril(10-3) mmol/L 30.8±3.6* 39.2±2.8* H2/R4 +capotril(10-2) mmol/L 20.4±2.8* 27.8±3.5* The expression of caspase-3,9 were detected by immunocytochemistry.the Caspase-3、9 were activated in HUVEC during hypoxia/reoxygenation， expression of caspase-3.9 in HUVEC preconditioning with catopril were significantly decreased in contrast with hypoxia/reoxygenation group and significantly decreased followed the catopril concentration increasing.3討論本實驗在離體培養(yǎng)的人臍靜脈內(nèi)皮細胞上，給予不同濃度的卡托普利處理后進行缺氧復氧損傷，從中發(fā)現(xiàn)卡托普利預處理組的Caspase3、9表達明顯低于缺氧復氧組，且隨著卡托普利濃度的增加而逐漸降低，這說明卡托普利具有抑制Caspase蛋白表達的作用，并且這種抑制作用與卡托普利的濃度具有量-效關(guān)系。缺血再灌注損傷是一種常見的臨床病理生理過程，與心肌梗死，心絞痛等心血管疾病密切相關(guān)，故一直是醫(yī)學界研究的熱點問題之一。血管內(nèi)皮細胞位于血液與組織之間，是各血管組織缺血及再灌注損傷過程中最先受損的部位，大量的在體和離體實驗均以證實缺血再灌注可以導致內(nèi)皮細胞凋亡[13-16]。細胞凋亡不但是缺血再灌注損傷的特征之一，而且細胞凋亡可以加重缺血再灌注損傷，細胞凋亡的多少決定了缺血再灌注損傷的輕重。故通過研究VEC缺氧復氧損傷性凋亡的機制和卡托普利預適應的VEC保護作用來抑制細胞凋亡，對治療缺血缺氧性疾病有重要的理論和臨床意義。細胞凋亡可在四個水平被抑制,即干擾凋亡的刺激因素、在受體/配體水平的功能性拮抗、阻斷信號轉(zhuǎn)導、抑制催化性酶,如Caspase、核酸內(nèi)切酶等。目前，對缺氧再灌注損傷導致細胞凋亡及卡托普利預處理的保護機制尚不十分明確?？紤]可能與以下幾種因素相關(guān)：（1）氧自由基：我們以往的實驗證實單純?nèi)毖鹾腿毖鯊脱蹙僧a(chǎn)生大量的超氧陰離子自由基，它可能通過以下幾種途徑誘導細胞凋[16]。①直接損傷DNA，導致細胞凋亡的發(fā)生。②攻擊蛋白質(zhì)，使許多蛋白尤其是具有酶活性的蛋白功能喪失。③影響核基因轉(zhuǎn)錄，改變細胞表型特征，誘導凋亡。④直接作用于細胞質(zhì)膜，引起脂質(zhì)過氧化反應，從而影響細胞轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)，最終激活Caspase蛋白及有關(guān)調(diào)控凋亡的基因，導致細胞凋亡。而經(jīng)過卡托普利預處理后的內(nèi)皮細胞，由于卡托普利本身含有巰基（SH），不但具有抑制微粒體脂質(zhì)過氧化反應及白細胞產(chǎn)生氧自自由基的作用，而且本身是強有力的氧自由基清除劑。Tambd[17]等研究發(fā)現(xiàn)卡托普利對缺血再灌注過程中產(chǎn)生氧自由基所至的細胞凋亡具有明顯的抑制作用，這與我國學者胡青松等[18]研究發(fā)現(xiàn)卡托普利具有抑制羥自由基誘導血管內(nèi)皮細胞、心肌細胞凋亡的結(jié)論相一致。由此可見，卡托普利通過抑制和清除氧自由基的雙重作用來阻止氧自由基氧化PT孔上的硫醇P所致T孔開放，此外卡托普利所含有巰基（SH）也可使PT孔處于關(guān)閉狀態(tài)，穩(wěn)定了線粒體膜電位，阻止Cyt-C及凋亡誘導因子（AIF）從線粒體中釋放，有效降低了缺血再灌注損傷過程中Caspase3、9的激活，從而抑制細胞凋亡。（2）各種凋亡相關(guān)基因的作用：①Bcl-2家族：Bcl-2家族由兩類功能相反的蛋白組成,Bcl-2、Bcl-XL、A1及Mcl-1抑制凋亡,而Bax、Bcl-Xs、Bad和Bak促進凋亡。Bcl-2對細胞凋亡的調(diào)控作用主要是通過線粒體依賴性途徑實現(xiàn)：Bcl-2蛋白可以在線粒體膜形成陽離子通道，它插入到線粒體膜后通過質(zhì)子流動和電壓依賴性陰離子通道（VDAC）來抑制滲透性轉(zhuǎn)變孔開放，從而防止細胞色素C、凋亡誘導因子（AIF）等促凋亡因子從線粒體釋放，阻止了Caspase-3、9的激活，最終抑制細胞凋亡[19-20]。此外Bcl-2還可以直接與胞漿中Caspase-9連接的Apaf-1相結(jié)合而存在于線粒體外膜，通過形成線粒體—Bcl-2—Apaf-1—Caspase-9的四聚復合物的形式對Apaf-1的結(jié)構(gòu)進行調(diào)控，使Apaf-1失去對Caspase酶系的活化從而抑制細胞凋亡[21]。Matsushita研究小組證明,缺氧處理可使內(nèi)皮細胞Bcl-2水平明顯降低,而Bax水平?jīng)]有變化,抗凋亡蛋白Bcl-2水平的降低與細胞凋亡相關(guān)[8]。對人冠狀動脈內(nèi)皮細胞的研究也發(fā)現(xiàn)缺氧再灌注可使Bcl-2水平降低[22]，而Stempien-Otero等發(fā)現(xiàn)在臍靜脈內(nèi)皮細胞缺氧性凋亡時,Bax和Bcl-XL水平均未發(fā)生變化,Bax/Bcl-XL的比例似乎與細胞凋亡并無相關(guān)[23]。從中我們可以推測Bcl-2的水平降低在缺血再灌注損傷導致細胞凋亡的病理過程中起著重要作用。同時Liangxuguo[24]等應用卡托普利和氯沙坦干預由血管緊張素II（AngII）所誘導的血管內(nèi)皮細胞凋亡的實驗中發(fā)現(xiàn)，還能降低促凋亡基因表達，上調(diào)抗凋亡基因Bcl-2的表達，從而抑制Caspase-9的激活并阻斷了Caspase-3激活所依賴的線粒體途徑，減少了Caspase-3的活化而發(fā)揮抗細胞凋亡的作用。（3）AngII與其相應的受體AT1結(jié)合并共同作用，在增加AT1受體蛋白的表達的同時并明顯上調(diào)促凋亡基因的表達，進而激活caspase-3導致細胞凋亡[25]；而卡托普利通過抑制血管緊張素轉(zhuǎn)化酶的活性，阻止了AngI轉(zhuǎn)換為AngII，從而不但使AngII所產(chǎn)生的氧自由基和炎性介質(zhì)減少，而且部分阻斷AngII與其相應受體結(jié)合所至的細胞凋亡作用。同時，還能降低促凋亡基因表達，上調(diào)抗凋亡基因Bcl-2的表達，從分子水平發(fā)揮抗細胞凋亡的作用[24]。此外卡托普利還能通過減少緩激肽的降解，使增加的緩激肽通過與其β2受體結(jié)合,進而激活磷酸酯酶C(PLC),產(chǎn)生的IP3使細胞內(nèi)Ca2+釋放而一氧化氮合酶（NOS）和上調(diào)ecNOS，從而增加一氧化氮（NO）的產(chǎn)生[26]，而一氧化氮可以通過半胱氨酸的S亞硝基化來抑制caspase-3的表達，從而減少細胞凋亡[27-28]．Fnjita N[29]通過實驗證明，內(nèi)皮細胞提前經(jīng)ACEI類藥物和緩激肽處理后可以明顯減少H/R引起的內(nèi)皮細胞的凋亡和乳酸脫氫酶的釋放，且此作用可以被B2受體阻斷劑和一氧化氮合酶抑制劑取消，從而證明，ACEI可以通過上調(diào)緩激肽水平從而使一氧化氮合酶活性增加，提高NO的釋放，從而達到保護內(nèi)皮細胞的作用。 通過本實驗，我們發(fā)現(xiàn)，缺氧再灌注損傷導致的細胞凋亡是可以干預的，從而提示我們可以從減輕細胞凋亡的角度預防缺氧再灌注損傷對細胞的結(jié)構(gòu)和功能的破壞。即通過清除凋亡誘發(fā)因素，抑制凋亡的信息傳導通路，減少細胞損傷，這將會為保護缺氧再灌注損傷提供新的治療途徑，具有重要的治療價值。結(jié) 論 本實驗證明，卡托普利晚期預處理后，內(nèi)皮細胞在缺氧復氧損傷過程中，Caspase3，9的表達明顯降低，且與卡托普利的濃度具有量-效關(guān)系。結(jié)合進一步的研究我們分析，卡托普利預處理可以通過激活緩激肽B2受體、清除氧自由基、上調(diào)bcl-2的表達等多種機制來抑制Caspase3，9在內(nèi)皮細胞缺血再灌注損傷期間的激活從而發(fā)揮內(nèi)皮細胞的保護作用。同時亦表明卡托普利對血管內(nèi)皮細胞缺氧/復氧損傷的保護作用至少是部分通過降低Caspase-3、9的表達來抑制細胞凋亡而實現(xiàn)的。參考文獻[1]. 宋秋景 李建元。缺血預適應的研究現(xiàn)狀和前景。 中國藥理學與毒理學雜志，2000，14（1）：1-7.[2].Pomerantz B J,Joo K,Shames B D,et al.Andenosine preconditioning reduces both preand postischemias in human myocardium..J Surges. 2000,90[2]:191-196[3] Brenner C,Kroe G.The mitochondrion: decisive for cell death contronl Signaling pathway in apoptosis [M]. Hawood acadamic publishers ,1999:207-216[4] Wolf BB ,Green DR.Suicidal tendencies :apoptotic cell death by caspase family proteinases. J Biol Chem 1999,274-:20049-20052[5]Matsushita H,Morishita R,Nata T et al.Hypoxia-induced endothelial apoptosis through nuclear factor-kappaB(NF-kappaB)-mediated bcl-2 suppression: invivo evidence of the importance of NF-kappaB in endothelial cell regulation [J].Circ Res,2000;86(9):974-981[6] Nicholson DW,Ali A,Thornberry NA ,et al.Identification and inhibition of the ICE/CED-3 protease necessary for mammalian [J]Nature, 1995, 376 (6535): 37-43[7] Roy S,Bayly CI,Gareau Y,et al Maintenance of caspase-3 proenzyme dormancy by an intrinsic “safety catch” regulatory tripeptite.[J] Procnatl Acad Sci USA ,2001,98(11):6132-6137[8].Saikumar P,Dong Z,Mikhailov V et al. Apoptosis:definition ,mechanism and relevance to disease.[J].Am J Med,1999,107(5):489-506[9] Condorelli G ,Roucarati R ,Ross JJ et al.Heart targeted overexpression of caspas-3 in mice increase and depresses cardiac function [J] Proc Natl Acad Sci USA.2001,98(7):9977-9982[10] Cain K,Bratton SB ,Langlas C et al. Apaf-1 oligomeries into biologically active approximately 700-KD and inactive appromately 1.4MD a appoptsome complexes [J] Biol,Chem,2000,275(9):6067-6070[11]. Budihardjo I,Oliver H,Lutter M,et al .Biochemical patchways of caspase activation during apoptosis.Annu Rev .Cell Dev Biol, 1999,15:269-278 [12] 蘇定馮 心血管藥理學(M) 第一版 北京 科學技術(shù)出版社 2001,241-249[13].Holleyman C, Larson D,Hunter K.Stimulation of ischemia reperfusion in endothelialcell culture increase apoptosis J Extra Corpor Technol 2001 Sep, 33(3):175-180[14] Zhang J,Tan Z, Tran ND. Chemical hypoxia-ischemia induces apoptosis in cerebromicrovascular endothelial cell Brain. Res 2000 Sep 22,877(2): 134- 140[15] Hong N,Browning J, Howard T, Winterford C et al. Apoptosis in vascular endothelial cells caused by serum deprivation,oxidative stress and transfo-rming growth factor-beta.Endothelium 1999,7(1):175-180[16] Ing DJ, Zang J, Dzau VJ. Modulation of oytokine-induced cardiac myocyte apoptosis by nitric oxide,Bak and Bcl-x. Circ Res, 1999;84:21-33.[17] Tamba M ，Torreggiani A. Free radical scavenging and copper chelation：a potentially beneficial action of captopril . Free Radic Res，2000;32（3）：199-211[18]羅偉，姜醒華 ,羅偉 羥自由基誘導血管內(nèi)皮細胞.心肌細胞凋亡及卡托普利的干預作用 江西醫(yī)學院學報 2001，41（2）136-139[19] Gross A, Mcdonnell JM,Korsmeyer SJ .Bcl-2 family members and the mitochondria in apoptosis [J] Genes Dev ,1999,13(15):1899-1908[20] Yang J,Liu XS,Bhala K,et al.Prevention of apoptosis by bcl-2:Cytochrome c from mitochondria blocked[J].Science 2000,275(21):1128-1142[21] Brenner C, Thornberry NA,Lazebink Y. Bcl-2 and Bax regulation the channel activity of the mitochodrial adenine nucleotide translocator .Oncogene 2000,19:329-336[22]Li D,Tomson K,Yang B,et al.Modulation of constitutive nitric oxide synthase, Bcl-2 and Fas expression in cultured human coronary endothelial cells exposed to noxia-reoxygenation and angiotensin :role of AT1 receptor activation [J].Cardiovasc Res,1999;41(1):109-115[23]Stempien-Otero A,Karsan A,Cornejo CJ,et al. Mechanisms of hypoxia induced endothelial cell death:role of p53 in apoptosis [J]. Biol Chem, 1999 ;274:8039-8045[24] 梁緒國，潘其星 氯沙坦和卡托普利合用對凋亡基因調(diào)控的影響。國外醫(yī)學：心血管疾病分冊：2003.3.30卷（2）：112-115[25] Goldenberg I,Grossman E ,Masaki H et al Angiotensin II induced apoptosis in rat cardiomyocytes cuture opossible role of AT1 and AT2 receptors J Hypertension 2001 Sep:19(9):1681-96[26]Matsumoto N, Mannabe H ,Ochiai J et al An AT1 receptor antagonist and angiotensin-coverting enzyme inhibitor in hunan aortic endothelial cells throught upregulation of endothelial cell nitric oxide synthase activity . Shock 2003 Jun:19(6):12(3):316-318[27] Li J, Bratton SB, Kunkel G et al.Nitric oxide reversibly inhibit seven members of the caspase family via s-nitrosylation .[J] Biol Chem , 1999, 274:17325-17336[28].Hoffmann J,Haendeler J,Aicher A et,al.Aging enchances the sensitivity of endothelial cells toward apoptotic stimuli important role of nitric oxide Circ Res ,2001,89(8):709-715[29]FnjitaN, Manabe H, Yoshida N et al. Inhibition of angiotension-converting enzyme protects endothelial cell against hypoxia/ reoxygenation injury. Biofactors, 2001; 11(4):257-266本研究先進性1．本實驗根據(jù)缺血和缺氧有著極其相似的病理改變和發(fā)病機制，故設(shè)計以培養(yǎng)的人臍靜脈內(nèi)皮細胞的缺氧復氧模型來模擬缺血再灌注損傷模型，而且為了更好的模擬在體時細胞的缺血再灌注狀態(tài)，在缺氧時我們采用缺氧液培養(yǎng)細胞，除造成缺氧外，同時限制糖，鈣及液體量，而在復氧時則用含糖，鈣的復氧液，并給予充分的氧，以滿足再灌注的條件。2．本實驗依細胞凋亡的經(jīng)典途徑為基礎(chǔ)，通過檢測凋亡過程中的關(guān)鍵酶Caspase3、8、9，來研究缺血再灌注損傷導致血管內(nèi)皮細胞凋亡的相關(guān)機制。3．缺氧和缺氧復氧均可以引起血管內(nèi)皮細胞的Caspase3、9表達，且表達程度與缺氧復氧損傷時間具有顯著的依賴性，這說明Caspase-3， Caspase—9參與了缺氧/復氧誘導HUVEC凋亡這一病理；4．同時Caspase—8的表達在缺氧/復氧誘導細胞凋亡的整個過程中，無明顯變化，從中我們可以推測缺氧/復氧誘導血管內(nèi)皮細胞凋亡主要是通過線粒體途徑進行的。這將有助于為尋找適當?shù)闹委煱悬c提供理論參考。5卡托普利晚期預處理可以降低血管內(nèi)皮細胞的Caspase3、9表達，此種抑制作用具有劑量依賴性。6卡托普利晚期預處理可以通過激活緩激肽B2受體、清除氧自由基、上調(diào)bcl-2的表達等多種機制來抑制Caspase3，9在內(nèi)皮細胞缺血再灌注損傷期間的激活從而發(fā)揮內(nèi)皮細胞的保護作用。同時亦表明卡托普利對血管內(nèi)皮細胞缺氧/復氧損傷的保護作用至少是部分通過降低Caspase-3、9的表達來抑制細胞凋亡而實現(xiàn)的。中文摘要缺血再灌注損傷的防治一直是心血管領(lǐng)域研究的重點課題。缺血預適應（ischemic preconditionging，IPC）是體內(nèi)最強大的保護機制，是一種多元性細胞防御現(xiàn)象。IPC的保護作用不僅存在于器官水平，而且存在于細胞水平，不僅可以保護心肌細胞，而且可以保護血管內(nèi)皮細胞，血管平滑肌細胞。這一現(xiàn)象的發(fā)現(xiàn)，為缺血心肌的保護及其機制的探討開辟了新的領(lǐng)域。且目前的研究已經(jīng)明確的證實缺氧預處理和缺血預處理具有相似的效應。由于缺血本身是一種損傷，實施損傷性預處理臨床還難以接受，目前誘導預處理的研究已從缺血、生物、物理、化學源性擴展到藥物性預處理。藥物性預處理（pharmacologic preconditioning）是通過藥物激發(fā)或模擬機體內(nèi)源性物質(zhì)呈現(xiàn)的心臟保護作用。血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑（ACEI）具有藥物預適應作用。ACEI通過誘導或增強預處理早期心臟保護作用已有較多研究，而誘導預處理的延遲保護作用的報道不多；因此，為了研究ACEI晚期預處理在血管內(nèi)皮細胞缺血再灌注損傷中的保護作用，我們在實驗中建立血管內(nèi)皮細胞缺血再灌注（缺氧復氧）損傷模型，選用卡托普利（ACEI代表藥，非前體藥），探討卡托普利和Caspase-3、8、9在人臍靜脈內(nèi)皮細胞缺氧/復氧損傷中的作用。我們把人臍靜脈內(nèi)皮細胞分為正常對照組、缺氧/復氧組、和卡托普利預處理組；分別進行缺氧2小時復氧1小時、2小時、3小時、4小時；用免疫組化檢測Caspase-3、8、9表達。實驗結(jié)果顯示缺氧/復氧組隨著復氧時間的延長， Caspase-3、9表達亦隨著復氧時間的延長而進行性增加，尤以復氧4小時最為明顯；而Caspase—8表達無明顯變化。.卡托普利預處理組的Caspase蛋白表達變化與缺氧/復氧組相似，但明顯下降，并且細胞的Caspase蛋白表達隨著卡托普利的濃度的增加而

摘要:目的 觀察曲美他嗪治療不穩(wěn)定型心絞痛的臨床療效。 方法 120例不穩(wěn)定型心絞痛病人隨機分為治療組(60例)與對照組(60例)。對照組給予硝酸酯類藥物、阿司匹林、他汀類降脂藥、β受體阻滯劑或鈣離子拮抗劑等常規(guī)治療。治療組在上述治療的基礎(chǔ)上加用曲美他嗪，每次20 mg,每日3次口服,連用14 d。結(jié)果 心電圖療效,治療組總有效率為95.0%,對照組為73.3%;心絞痛療效,治療組總有效率為93.3%,對照組為66.7%。兩組比較均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。結(jié)論 曲美他嗪可有效控制不穩(wěn)定型心絞痛發(fā)作,安全方便。關(guān)鍵詞:不穩(wěn)定心絞痛；曲美他嗪；1資料和方法1.1病例選擇和分組，以中華醫(yī)學會心血管病學會制定的《不穩(wěn)定心絞痛診斷和治療建議》為標準[2]，選取我院循環(huán)內(nèi)科2008年2月—2009年12月的住院患者120例，其中排除嚴重肝腎功能不全、有出血傾向或凝血功能異常、近期有手術(shù)或其他出血性疾病以及嚴重高血壓未有效控制者。將入選病例隨機分成2組：對照組60例，年齡45-75歲，男性32例，女性28例，其中初發(fā)心絞痛20例，惡化勞力型心絞痛 28例，靜息性心絞痛 7例，梗死后心絞痛5例；治療組60例，男性31例，女性29例，其中初發(fā)心絞痛19例，惡化勞力型心絞痛 27例，靜息性心絞痛 7例，梗死后心絞痛7例.治療組和對照組在年齡、性別、心絞痛類型及其危險分層差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。1.2方法：對照組常規(guī)應用阿司匹林抗凝、他汀類調(diào)脂、硝酸脂類藥物擴冠，β受體阻滯劑或鈣離子拮抗劑。治療組在常規(guī)治療基礎(chǔ)上加用曲美他嗪(萬爽力,法國施維雅藥廠)每次20 mg次20 mg,日3次口服，連續(xù)用14天。1.3觀察指標：住院治療期間觀察記錄心絞痛的發(fā)作頻率，硝酸甘油的日使用量及常規(guī)檢測血壓，心率及心電圖。治療前后均行血尿常規(guī)及肝腎功能檢查。1.4療效判定標準 以1993年衛(wèi)生部制定的《心血管系統(tǒng)藥物臨床研究指導原則》為評判標準：（1）顯效：同等勞累程度不引起心絞痛或心絞痛發(fā)作次數(shù)較少80%以上，硝酸甘油用量減少80%以上，靜息時心電圖恢復正常,；（2）有效：心絞痛發(fā)作次數(shù)及硝酸甘油消耗量均減少50%~80%，ST段下移回升≥0.05mv,但未達到正常水平，主要導聯(lián)的T波倒置變淺或由低平轉(zhuǎn)為直立；（3）無效：心絞痛發(fā)作頻率及硝酸甘油用量均減少不到50%，治療前后的靜息或次極量運動心電圖ST-T無變化。1.5資料統(tǒng)計學處理 選用統(tǒng)計學軟件包SPSS13.0進行數(shù)據(jù)分析，臨床療效和心電圖療效均采用χ2檢驗，計量資料用均數(shù)±標準差表示，組間比較采用t檢驗以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。2 結(jié)果2.1 兩組心絞痛臨床療效對比（表1）表1 兩組心絞痛療效比較例(%)組別 n 顯效 有效 無效 總有效對照組 60 25(41.7) 16(26.7) 19(31.6) 42(70.0)治療組 60 39(65.0) 17(28.3) 4(6.7) 56(93.3) 注:兩組總有效率比較,P<0.05。2.2 兩組心電圖療效比較(見表2)表2 兩組心電圖療效比較例(%)組別 n 顯效 有效 無效 總有效對照組60 28(46.7) 15(25.0) 17(28.3) 43(71.6)治療組60 38(63.3) 18(30.0) 4(6.7) 57(95.0)注:兩組總有效率比較,P<0.05。2.3 藥物不良反應 治療組在治療期間未發(fā)現(xiàn)與曲美他嗪相關(guān)的副作用。3 討論 不穩(wěn)定心絞痛是由于心肌需氧與供氧之間暫時失去了平衡而發(fā)生的心肌代謝障礙，有氧氧化受到抑制，一方面乳酸大量堆積導致酸中毒而引起使心肌收縮功能異常;另一方面三磷酸腺苷ATP產(chǎn)生不足，鈉鉀泵受到抑制，引起線粒體內(nèi)鈣超載，導致線粒體腫脹，造成心肌細胞不可逆的損傷。因此針對心肌缺血時的代謝變化進行治療，采取改善心肌能量代謝已成為現(xiàn)代治療冠心病的重要手段[4-5].。曲美他嗪是一種哌嗪類衍生物，它可以改變心肌細胞的有氧代謝途徑，增加ATP生成，減輕細胞內(nèi)鈣超載，保護線粒體的結(jié)構(gòu)和功能，同時通過提高氧自由基清除酶的活力減少氧自由的產(chǎn)生并抑制氧自由基對細胞膜的氧化反應，減輕其對心肌細胞的毒性，從細胞水平發(fā)揮其抗心肌缺血的藥理作用。此外，由于曲美他嗪是通過代謝效應治療心肌缺血，從而具有不影響血液動力學變化，不增加心肌耗氧量，不降低心肌收縮力的其他傳統(tǒng)治療無法比擬的優(yōu)點。本研究表明傳統(tǒng)治療方法聯(lián)合曲美他嗪治療冠心病不穩(wěn)定型心絞痛的臨床療效、心電圖改善情況均優(yōu)于單純傳統(tǒng)治療, 且不影響心率、血壓變化,無嚴重不良反應出現(xiàn),無一例出現(xiàn)急性心肌梗死及猝死,因此曲美他嗪治療冠心病不穩(wěn)定型心絞痛安全、有效、值得臨床推廣。[參 考 文 獻][1] 滕堯文.曲美他嗪治療不穩(wěn)定型心絞痛的療效評價[J].中國心血管研究雜志,2005,3(3):212-213.[2] 中國醫(yī)學會心血管分會.不穩(wěn)定性心絞痛診斷和治療建議[J].中國循環(huán)雜志,2001,16(3):227-229.[3] 中華醫(yī)學會心血管病學分會,中華心血管病雜志編輯委員會.慢性穩(wěn)定性心絞痛診斷與治療指南[J].中華心血管病雜志, 2007,35(3): 195-205. [4] Palerini T,Sangiorgi D,M arzocchi A,et al. Impact of acute coronary syndromes on two year clinical outcomes in patients with unprotected left main coronary artery stenosis treated with drug-eluting stents[J ] Am J Cardiol 2010 ,105(2):174-178[5] Thadani U .Seletion of optimal theraphy for chronic stable angina [J] .Curr Treat Options Cardiovasc Med 2006.8(1):23-35

摘要]目的 研究卡托普利干預細胞凋亡的作用及相關(guān)機制。方法 本文采取文獻回顧的方法對卡托普利干預細胞凋亡的作用及相關(guān)機制作一綜述。結(jié)果 卡托普利具有抑制和誘導細胞凋亡的雙重作用。結(jié)論 卡托普利能夠通過多種機制調(diào)節(jié)細胞凋亡。[關(guān)鍵詞] 卡托普利 干預 細胞凋亡 Advances in Research of Captopril Intervening Cell ApoptosisSuTeng ZhengYang collation[Obstract] objective to investigate the function of captopril intervening apoptsis and its releavant mechanism . Method the published papers to explore the function and machanism of captopril intervening apoptosis were reviewed. Result Captopril not only can hold back but also induce cell apoptosis .Conclusion captopril regulate cell apoptosis by several mechanisms[key words] Captopril regulate apoptosis卡托普利是第一個口服有效的血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑，自從1981年由美國FDA批準用于治療高血壓以來，卡托普利在治療充血性心力衰竭，心肌梗死后的心室重構(gòu)和糖尿病腎病中取得了良好的療效。它在血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑中應用范圍最廣[1]。隨著相關(guān)基礎(chǔ)科學的迅猛發(fā)展和對卡托普利藥理作用研究的深入，近來人們在大量的動物和臨床實驗中發(fā)現(xiàn)卡托普利具有抑制和誘導細胞凋亡的雙重作用[2-7]，本文采用文獻回顧的方法對卡托普利干預細胞凋亡的作用及相關(guān)機制作一綜述。1卡托普利的藥理作用卡托普利是含有巰基（SH）的血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑,它不但具有其他的血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑藥理作用：（1）阻止血管緊張素II(AngII)的生成和作用；（2）保存緩激肽的活性；（3）保護血管內(nèi)皮細胞與抗動脈粥洋硬化作用；（4）抗心肌缺血和心肌保護作用；（5）增加糖尿病病人對胰島素的敏感性；（6）阻止心血管病理性重構(gòu)，而且能通過所含有的巰基清除氧自由基，抑制脂質(zhì)過氧化反應，起到穩(wěn)定線粒體膜的作用[8]，此外卡托普利還具有抑制單核巨噬細胞產(chǎn)生腫瘤壞死因子，白細胞介素等細胞因子的免疫學效應[9]。2: 細胞凋亡2.1 細胞凋亡的概念及其基因調(diào)控細胞凋亡是指在一定的生理和病理條件下,遵循自身的程序通過啟動內(nèi)部機制,主要是內(nèi)源性DNA內(nèi)切酶的激活,從而結(jié)束其生命的過程.目前的研究表明，細胞凋亡是基因調(diào)控的一種細胞死亡的特殊形式，其調(diào)控基因可分為促凋亡基因，包括野生型P53.c-myc，c-fas，c-jun，bcl-bax，ras，IC等基因；抑凋亡基因主要包括Bcl-2和突變型P53。自1972年Kerr[10]等首次提出細胞凋亡概念以來, 細胞凋亡一直是近年來醫(yī)學界的研究熱點.2.2細胞凋亡的通路細胞凋亡的通路主要有兩條,一條是死亡受體途徑[11]：死亡受體屬于腫瘤因子受體(TNFR)超家族,包括Fas, TNFR1,DR3 ,DR4和DR5,在胞內(nèi)部分含有一個死亡域(DD),以此招募下游的凋亡蛋白。Fas配體是一個同源三聚體，每個三聚體分子結(jié)合3個Fas分子。一旦與三聚體的配體相結(jié)合，F(xiàn)as通過胞內(nèi)段的DD和FADD羧基端的DD之間的相互作用，募集胞質(zhì)中的銜接蛋白FADD。FADD氨基端含有DED，此DED和Caspase-8原域的DED相互作用，把Caspase-8募集到Fas區(qū)域。Fas、FADD和Caspase-8形成了死亡誘導信號復合體（DISC）。Caspase-8酶原有弱的蛋白水解活性，在DISC中Caspase-8由于寡聚化水解活性增強，而自我剪切活化 。活化的Caspase-8釋放到細胞質(zhì)中即激活Caspase—3，引起細胞凋亡；另一條是線粒體途徑[12]：線粒體通路[2]：各種促凋亡信號如DNA損傷、生長因子去除等誘導線粒體釋放細胞色素C，在ATP/dATP存在的情況下，細胞色素C結(jié)合到Apaf-1的WD40重復區(qū)域，促使Apaf-1寡聚化，形成Apaf-1-細胞上色素C多聚復合體。此復合體通過Apaf-1的氨基端的CARD與Caspase-9原域的CARD之間的蛋白—蛋白相互作用，以1：1比例募集胞質(zhì)的Caspase—9。Caspase—9酶原之間因相互靠近自我剪切而活化。Caspase—9作為起始半胱氨酸蛋白酶激活下游的Caspase—3促使細胞凋亡。3卡托普利抑制細胞凋亡3.1卡托普利抑制AngII誘導的細胞凋亡AngII對細胞凋亡有重要的影響，但作用機制較復雜，不同的細胞表現(xiàn)出不同的作用：既可以引起細胞凋亡，也可以引起細胞增生[13]，這主要與AngII和其相應的受體AT1，AT2結(jié)合所發(fā)揮的生物學效應有關(guān)。Goldenberg I[14]等實驗發(fā)現(xiàn)AngII與其相應的受體AT1，AT2結(jié)合并共同作用，在增加AT1，AT2受體蛋白的表達的同時并明顯上調(diào)促凋亡基因的表達，進而激活caspase-3導致細胞凋亡。但亦有研究表明：AT1受體和AT2受體與AngII結(jié)合而發(fā)揮的作用相反：即AT1受體與AngII結(jié)合具有促進細胞增生的作用；AT2受體與AngII結(jié)合具有誘導的細胞凋亡作用[15]。這與Liangxuguo[16]等應用卡托普利和氯沙坦干預由AngII所誘導的血管內(nèi)皮細胞凋亡的實驗內(nèi)結(jié)果相一致：氯沙坦作為AT1受體拮抗劑，雖然阻斷了AngII與AT1的結(jié)合,但對AngII所誘導的細胞調(diào)亡無影響，從而說明AT1受體在AngII所誘導的細胞凋亡過程中無明顯作用；而使用卡托普利能部分抑制AngII誘導的血管內(nèi)皮細胞凋亡，其可能機制為卡托普利通過抑制血管緊張素轉(zhuǎn)化酶的活性，阻止了AngI轉(zhuǎn)換為AngII，從而不但使AngII所產(chǎn)生的氧自由基和炎性介質(zhì)減少，而且部分阻斷AngII與其相應受體結(jié)合所至的細胞凋亡作用。同時，還能降低促凋亡基因表達，上調(diào)抗凋亡基因Bcl-2的表達，從分子水平發(fā)揮抗細胞凋亡的作用[17]。此外還與卡托普利能減少緩激肽的降解，增加NO的分泌有關(guān)[18]。3.2卡托普利抑制氧自由基誘導的細胞凋亡氧自由基可以通過直接損傷DNA，攻擊含有酶活性的蛋白質(zhì)，影響核基因轉(zhuǎn)錄，引發(fā)脂質(zhì)過氧化反應等多種途徑誘導細胞凋亡。這已經(jīng)在大量的實驗中得以證實。同時，亦有實驗證明用抗氧化劑或氧自由基清除劑干預氧自由基誘導的細胞凋亡，能通過阻止P53的激活、下調(diào)Bax蛋白的基因表達及降低Caspase-3的活性而抑制細胞凋亡[19]。而卡托普利本身含有巰基（SH），不但具有抑制微粒體脂質(zhì)過氧化反應及白細胞產(chǎn)生氧自自由基的作用，而且本身是強有力的氧自由基清除劑 [20]。Tambd[21]等研究發(fā)現(xiàn)卡托普利對缺血再灌注過程中產(chǎn)生氧自由基所至的細胞凋亡具有明顯的抑制作用，這與我國學者胡青松[22-23]研究發(fā)現(xiàn)卡托普利具有抑制羥自由基誘導血管內(nèi)皮細胞、心肌細胞凋亡的結(jié)論相一致。由此可見，卡托普利通過抑制和清除氧自由基的雙重作用來阻止氧自由基氧化PT孔上的硫醇所激發(fā)PT孔開放，同時，卡托普利所含有巰基（SH）可使PT孔處于關(guān)閉狀態(tài)[24]，穩(wěn)定了線粒體膜電位，阻止Cyt-C及凋亡誘導因子（AIF）從線粒體中釋放，從而阻斷細胞凋亡的線粒體途徑而發(fā)揮抑制細胞凋亡的作用。同時卡托普利對線粒體復合體II-III質(zhì)子泵泵出速度和電子傳遞速度升高有調(diào)節(jié)作用，使質(zhì)子偶聯(lián)更緊密，從而保護線粒體的呼吸功能，改善細胞的能量代謝[25]，有效阻止氧自由基所造成的細胞內(nèi)鈣超載。3.3卡托普利阻止緩激肽降解而抑制細胞凋亡實驗證明卡托普利能通過減少緩激肽的降解，使增加的緩激肽通過與其β2受體結(jié)合,進而激活磷酸酯酶C(PLC),產(chǎn)生的IP3使細胞內(nèi)Ca2+釋放而導致一氧化氮合酶（NOS）增加、上調(diào)結(jié)構(gòu)型一氧化氮的基因表達（ecNOS），從而增加一氧化氮（NO）的產(chǎn)生[26]。NO對細胞具有雙重作用，即在通過產(chǎn)生氧自由基介導細胞凋亡的同時，可以通過抑制Caspase酶活性而產(chǎn)生抗細胞凋亡作用，作用結(jié)果與細胞類型和NO的量有關(guān)[27]。Dimmelers[18]等實驗證明NO能通過抑制Caspase酶活性而阻斷AngII所致的細胞凋亡作用，但Fukuok [28]等實驗發(fā)現(xiàn)NO能通過上調(diào)Fas及Bax的表達而介導細胞凋亡。因此我們可以認為卡托普利可能一方面通過適當增加NO水平，另一方面通過其所含有巰基而清除NO產(chǎn)生的過量的氧自由基而共同發(fā)揮抗細胞凋亡的作用。此外，通過緩激肽-NO 途徑可以激活蛋白激酶C，降低細胞代謝水平，降低ATP及氧的需求，改善細胞的能量代謝，阻止細胞凋亡[29]。3.4 其他最近研究發(fā)現(xiàn)卡托普利能阻斷由Fas受體介導細胞凋亡：UhalBD[4]等研究發(fā)現(xiàn)卡托普利通過降低肺泡上皮細胞表面的Fas和其配體（Fasl）的表達而抑制凋亡。此外Odakac Mizuochi T[30]等證實卡托普利通過干擾外周T細胞表面的Fas和Fasl之間的相互作用，并能降低凋亡過程中產(chǎn)生的Caspase-3類似物的活性而抑制凋亡。這為我們研究卡托普利在自身免疫病的應用開辟了新的道路。4卡托普利誘導細胞凋亡已有實驗證明卡托普利具有促進細胞凋亡的作用，Buemi M[5]等發(fā)現(xiàn)在實驗中卡托普利0.23mg可以引起血管平滑肌細胞凋亡數(shù)目增加，同樣Anne Mette[6]等動物模型中發(fā)現(xiàn)卡托普利通過誘導血管平滑肌細胞凋亡而抑制受損傷后血管內(nèi)膜的增生狹窄。這其中的具體機制還不清楚，可能是卡托普利能降低心肌梗死后血管內(nèi)膜AngII的AT1受體的mRNA的表達[31]，從而引起AngII與AT1結(jié)和所致的細胞增生及抗凋亡作用減弱，而與AT2 受體結(jié)合所致的細胞凋亡作用增強的結(jié)果[32-33]。此外Ohwada T[34]等研究發(fā)現(xiàn)對大鼠血管拉傷后給予血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑治療，不但可以明顯增加新生內(nèi)膜eNOS的表達,同時也可上調(diào)誘生型一氧化氮（iNOS）的表達，導致NO產(chǎn)生過多，而過多NO能通過上調(diào)Fas及Bax的表達，下調(diào)Bcl-2的表達誘導平滑肌細胞凋亡[28]。近來Glzzerman I[7]等在臨床上應用ACEI治療腎移植術(shù)后病人發(fā)生的紅細胞增多癥取得了成功，并闡明其作用機制為ACEI能誘導腎移植術(shù)后病人Fas及其接頭蛋白FADD的mRNA表達增加,上調(diào)其蛋白表達，但對BCL-2.Bcl-xl.Bax,caspase-8.caspase-3的表達無影響，從而通過激活死亡受體途徑誘導祖紅細胞凋亡。由此可見，卡托普利對細胞凋亡所具有促進的作用無疑有利于治療冠狀動脈手術(shù)后的內(nèi)膜增生和再狹窄，同時也為其治療IgA腎病及糖尿病腎病提供了新的理論基礎(chǔ)。問題和展望綜上所述，卡托普利具有抑制和誘導細胞凋亡的雙重作用。但目前的問題是卡托普利為什么會產(chǎn)生兩種截然不同的藥理作用。我們推測這主要取決于細胞類型，卡托普利的劑量以及機體所處病理狀態(tài)等因素，但具體的機制有待進一步研究?？傊?，卡托普利干預細胞凋亡的作用已經(jīng)得到了共識：卡托普利通過阻斷AngII與其受體之間的作用，減少氧自由基的產(chǎn)生，調(diào)控NO的合成，干擾Fas和Fasl之間的相互作用來激活或阻斷細胞凋亡程序，從而抑制或促進細胞凋亡。我們有理由相信：通過對卡托普利抗細胞凋亡作用深入研究，無疑為探討充血性心力衰竭，缺血再灌注損傷以及冠狀動脈粥樣硬化及手術(shù)后的再狹窄等帶來突破，并可推動心血管疾病治療的發(fā)展。參考文獻1 蘇定馮 心血管藥理學(M) 第一版 北京 科學技術(shù)出版社 2001,241-2492 LihlSuzukj J, Bayna E，Zhang FM et，al。Lipopolysaccharide induces apoptosis in adult rat ventricular myocytes via cardiac AT（1） receptors Am J，Physiol heart circ physiol 2002 ; Aug：283（2）：H461-73 Deaso ，Dumont C，Mollereau B et . al. Thiol-mediated inhibition of Fas and CD2 apoptotic singaling in activated human peripheral T cells Int，Immunol，1997.9：117-254 Uhal BD ，Gidea C，Bargout R et al.Captopril inhibits apoptosis in human lung epithelial cells a potential antifibrotic mechanism Am，J，Physoil. 1998：275：1013-75 Buemi M ， Allegra A，Marino D et al .Does captopril have a direct proapoptotic effect Nephron 1999,JAN;81(1):99-1016 Anne Mette ，Holm Claus Bogelund ，Peter Riis Hansen et al. ACE-inhibition promotes apoptosis after balloon injury of rat carotid arteries Cardiovascular Research , 2000;(45):777-7827 Glzzerman I,Patel H, Glicklich D et al .Angiotensin-coverting enzyme inhibition induces death receptor apoptosis pathways in erythoid precursors following renal transplantation. Am J Nephrol.2003 jul-Aug :23(4):195-2018 Constantinescu CS ,Goodman DB, Pauls H et al.Captopril and lisinopril suppress production of interleukin-12 by human peripheral blood mononu clear cells Immol letters 1998,62:25-319 Jay D Captopril and glutathione inhibit the superoxide dismutase activity of Hg(II) Arch Inst Cardiol Mex.1998,68:457-6110 Kerr JF, Wyllie AH ，Currie AR Apoptosis：a basic biological phenomenon with wide-ranging implications in tissue kinetics Br J cancer 1972，26（4）：239-5711 Ashkenazi A ,Dixit VM，Death receptors：singnaling and modulation （J） Science 1998，281（28）：1035-4112 Cain K ,Bratton SB ,Langlais C et al Apaf-1 oligomerizes into biologically active approximately 700-KDa and inactive approximately 1.4-MDa appoptsome complexes （J） Biol，chem ：2000：275（9）：6067-607013 Diep QN, EI Mabrouk, Yue P et al Effect of AT(1) receptor blockade on cardiac apoptosis in angiotensinII induced hypertension.Am J Physiol Heart Circ Physiol ,2002-May;282(5)H1:635-4114Goldenberg I,Grossman E ,Masaki H et al Angiotensin II induced apoptosis in rat cardiomyocytes cuture opossible role of AT1 and AT2 receptors J Hypertension 2001 Sep:19(9):1681-915 Mccarthy NJ ,Benett MR, The regulation of vascular smooth muscle cell apoptosis Cardiovase Res,2000,45(3): 747-75516 Liang xu guo, Hou gui hua,,Pan qi xing Effect of AngiotensinII captopril and losartan on apoptosis in vascular endothelial cells Juournal of ShanDong university ，2002：（40），44：300-30417 梁緒國，潘其星 氯沙坦和卡托普利合用對凋亡基因調(diào)控的影響。國外醫(yī)學：心血管疾病分冊：2003;3:30卷（2）：112-11518 Dimmerler S ,Rippmannn V，Weiland U et al .AngiotensinII induces apoptosis of human endothelial cells protective effect of nitric oxide circ Res 1997，81：970--97619 Oskarsson J, Coppy ,Weiss R et al Antioxidants attenuate myocyte apoptosis in the remote non-infarcted myocardium following large myocardial infarction (J) Cardiovasc Res.2000.45(3):679-68720 Sogaard P,Klausen IC, Rungby J et al Lipoprotein(a) and oxygen free radicals in survivors of acute myocardial infarction effects of captopril Cardiology 1996 .87(1):18-2221 Tamba M ，Torreggiani A. Free radical scavenging and copper chelation：a potentially beneficial action of captopril . Free Radic Res，2000，32（3）：199-21122 胡青松，羅偉 ,程曉署外源羥自由基誘導血管內(nèi)皮細胞凋亡及卡托普利的干預作用.江西醫(yī)藥。2002 ，37：（2）95-9823羅偉，姜醒華,羅偉 羥自由基誘導血管內(nèi)皮細胞.心肌細胞凋亡及卡托普利的干預作用江西醫(yī)學院學報 2001，41（2）136-13924 Vieira HL,Dorge H The mitochondrion:desive for cell death control ? signaling pathway in aooptosis Cell Death Differ 2000：7（12）：114625 蘇曉華，姜曉林 卡托普利對缺血再灌注心肌線粒體電子-質(zhì)子偶聯(lián)和氧化磷酸化的影響。中國病理生理 1996，12（3）：316-31826 Matsumoto N, Mannabe H ,Ochiai J et al An AT1 receptor antagonist and angiotensin-coverting enzyme inhibitor in hunan aortic endothelial cells throught upregulation of endothelial cell nitric oxide synthase activity . Shock 2003 Jun:19(6):12(3):316-31827 Stefanelli C , Pignati C ,Tantini B et al. Nitric Oxide can function as a killer molecule or antiapoptotic efector in cardiomyocytes Biochim Biophys Acta 1999,1450:406--1328 Fukuo K, Hata S ,Sohara T et al .Nitric oxide induces upregulation of fas and apoptosis in vascular smooth muscle Hypertension, 1996; 27:823-2629 Yoshida H,Zhang JJ ,Chao L et al Kallikrein gene delivery attenuates myocardial infrarction and apoptosis after myocardial ischemia and reperfusion Hypertension 2000;35:25-31 30 Odaka C ,Mizuochi T Angiotensin-converting enzyme inhibitor captopril prevents activation-induced apoptosis by interfering with T Cell activaton signals Clin Exp .2000.Sep;121(3):515-2231 Zhang Gx ,Pu Sy ,Yang Yz et al. Effect of losartan and captopril on expression of cardioc angiotensinII AT1 receptor mRNA in rats following myocardial in farction Zhongguo Yao Li Xue Bao.1997 sep;18(5):431-41232 Yamada T ,Akishita M,Pollman MJ et al .AngiotensinII type 2 receptor mediates vascular smooth muscle cell apoptosis and angiotensinII type 1 receptor action: an in vitro gene transfer study life .Sci 1998:63 :289-29533.Tea BS,Der PB, Sarkissian S et al Proapoptotic and growth-inhibitory role of angiotensinII type 2 receptor in vasucar smooth muscles cell of spontaneously hypertension rats in vivo Hypertension 2000,May,35(5):1069-73 34 Ohwada T, Ishibshi T ,Yaoita H et al .Different contribution of apoptosis to the antiproliferative effects of L-arginine.enalapril and losartan on neointimal growth inhibition after balloon arterial injury Circ J2002 Oct :66(10):965-71