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復旦大學附屬中山醫(yī)院

公立三甲綜合醫(yī)院

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疾?。? 急性上呼吸道感染
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急性上呼吸道感染科普知識 查看全部

靶向高通量測序在感染性疾病中的應用現(xiàn)在臨床上用的宏基因二代測序檢查，即高通量測序檢查項目，在三甲醫(yī)院普遍被應用，價格昂貴，而且屬于自費項目。我們來進一步認識一下這項高通量測序檢查項目的詳細分類和最新檢測技術進展。感染性疾病是全球致殘和致死的主要疾病之一，對于感染性疾病致病性微生物的檢測一直是臨床上的重點。傳統(tǒng)的病原體檢測技術面臨培養(yǎng)陽性率低、時間長、難以檢出苛養(yǎng)菌等局限性、近年來，高通量測序（high-throughputsequencing,HTS）的快速發(fā)展給病原體的檢測帶來新的突破，HTS在臨床實驗室中最常見的應用包括宏基因組高通量測序（metagenomicshigh-throughputsequencing,mHTS)、全基因組測序（wholegenmoesequencing,WGS)、靶向高通量測序（targetedhigh-throughputsequencing,tHTS）等。目前，mHTS應用最為廣泛。mHTS測序深度大、覆蓋面廣、測序效率高，可以在一次測序過程中測出樣本中所有的核酸序列，在檢測出病原微生物的同時對病原體進行種屬鑒定。相較于傳統(tǒng)的病原學檢測，mHTS的優(yōu)勢如下：①更高的靈敏度和準確性，彌補了傳統(tǒng)病原學檢測方法的不足：②更快的檢測速度，可以早期提供臨床信息；③更廣的檢測范圍，可以同時檢出臨床標本中的細菌、真菌、病毒、非典型病原體和寄生蟲，在檢測罕見、新發(fā)病原體方面更具有優(yōu)勢：④檢測結果受抗菌藥物經(jīng)驗治療的影響小。mHTS的局限性如下：①檢測結果易受人源序列的影響：②同時只能進行單一的脫氧核糖核酸（deoxyribonucleicacid，DNA）或核糖核酸（ribonucleicacid,RNA）測序；③價格昂貴等；④結果解讀困難；等等。mHTS仍在不斷地創(chuàng)新和發(fā)展，tHTS的出現(xiàn)從技術原理上彌補了HTS在病原學診斷中的部分不足。一、靶向高通量測序的技術原理tHTS是一種基于HTS的靶向富集的測序技術，通過對目標基因組感興趣區(qū)域（regionsofinterest,ROI）進行富集，確保ROI有足夠的測序深度和覆蓋度，這是確保HTS應用有效的關鍵步驟，目前，tHTS的靶向富集技術主要分為2種：基于超多重聚合酶鏈反應（polymerasechainre-action.PCR）擴增的PCR擴增法和基于探針雜交捕獲的探針雜交法。1．基于超多重PCR擴增的PCR擴增法其主要流程是針對感興趣的目標基因區(qū)域，利用目的基因區(qū)域兩側的序列設計多重PCR引物進行擴增富集，并將這部分區(qū)域放大幾千倍并進行測序。在核酸序列數(shù)量和質量有限的情況下，該方法也可以產(chǎn)生足夠的序列進行測序。通常需要多個引物同時工作，得到的擴增序列需要測序適配器連接完成文庫制備，之后進行測序分析。2．基于探針雜交捕獲的探針雜交法根據(jù)目的基因區(qū)域設計具有特異性序列的單鏈寡核苷酸（被稱為"探針"或者"誘餌")，這些探針可以是RNA或DNA，與特定基因組序列雜交后分離，以捕獲目標基因組序列。捕獲成功后進行測序適配器連接和少量PCR循環(huán)，以富集成功連接的片段并進行測序分析。與DNA探針相比，RNA探針在與DNA序列結合時具有更好的雜交特性和更高的穩(wěn)定性，從而提高捕獲的總體效率。RNA相對不穩(wěn)定限制了其使用，而DNA探針應用更為廣泛。以上2種方法對比，基于超多重PCR擴增的PCR擴增法具有核酸需求量低，工作流程更快、更簡單，脫靶測序率更低，適用于目的基因靶點較少的樣本，但其測序失敗率相對較高?；谔结橂s交捕獲的探針雜交法雖然無基因靶點數(shù)量的限制，且測序失敗率低，但其工作流程更加復雜、核酸需求量高?？偟膩碚f，上述這2種方法均適用于HTS目標富集，具體選擇哪種方法，應根據(jù)測序目的和測序條件綜合考慮。與mHTS相比：①tHTS針對特定的病原微生物序列進行擴增，可以減少甚至無視人源序列對檢測結果的影響；②tHTS可以同時進行DNA/RNA測序，可以一次檢測包括RNA病毒在內的病原微生物；③由于tHTS的病原檢測圖譜是經(jīng)過篩選的，檢測病原微生物的種類有限，故所需成本更低。二、靶向高通量測序的臨床應用1．靶向高通量測序對病原微生物的檢測效力傳統(tǒng)病原學檢測方法，靈敏度低、耗時長。現(xiàn)有的分子診斷方法，如定量聚合酶鏈反應（quantitativepolymerasechainre-action,qPCR）檢測范圍窄，mHTS在技術原理上仍存在諸多不足。tHTS作為新興的HTS，在技術原理上彌補了傳統(tǒng)病原學檢測的不足，改正了mHTS的一些缺陷。Li等設計了一個包括153種呼吸道感染病原體的tHTS測序平臺，可以覆蓋95％的常見呼吸道感染病原體。結果顯示，102例呼吸道感染患者中tHTS的檢出率為82.17%,mHTS為86.51%，兩者檢出率的差異無統(tǒng)計學意義（P=0.41)。tHTS的成本僅為mHTS的1/4，故在保持高靈敏度的基礎上，tHTS在成本方面更具有優(yōu)勢。tHTS可以同時進行DNA/RNA測序，一次測序就可以完成對細菌、真菌、病毒和非典型病原體的檢測。此外，tHTS還單獨檢出了鼻病毒，其在臨床應用上更具實用性。臨床上常需要面對多種病原微生物引起的感染，這就需要一種能同時檢測多種微生物的技術手段。研究表明，Sanger測序在檢測多重感染標本時，通常無法解釋檢測結果。雖然，mHTS有助于多重感染的鑒定，但是并不能有效區(qū)分定植菌和病原菌。近年來，有研究提出基于16SrRNA的HTS在多重微生物感染標本中有準確鑒定病原微生物種及定量細菌豐度的能力。Pitashny等進一步探索了基于16SrRNA的tHTS對多重感染的檢測效力。研究發(fā)現(xiàn)，在Sanger測序陰性的標本中，tHTS檢測出8例陽性，均為多重細菌。Robin等納入了2146例臨床實踐中的組織和液體標本，包括肺組織、漿膜液、骨組織、腦脊液、膿腫組織、心臟瓣膜等，分別使用培養(yǎng)方法、Sanger測序及tHTS對標本進行檢測。在肺組織中，相較于Sanger測序，tHTS的陽性率提高了300%。多重感染標本，tHTS具有強大檢測能力，故早期選擇tHTS具有重要臨床價值。tHTS對低載量微生物、苛養(yǎng)菌的檢出也具有優(yōu)勢。研究發(fā)現(xiàn)，利用靶向捕獲技術結合mHTS可以增加90%病毒核酸的載量，從而擴大目標微生物檢測覆蓋度，提高檢測的可信度。研究表明，通過靶向捕獲富集后，檢出病毒的序列數(shù)增加了674倍，病毒基因組的覆蓋度從2.1%提升至83.2%。得益于覆蓋度的提高，捕獲的tHTS可以用于分析基因組變異度高達58％的指環(huán)病毒。由此可見，tHTS在一定程度上降低了檢驗結果的解讀難度，更適合在臨床上被廣泛使用。綜上所述，tHTS對于病原微生物的診斷效力不亞于現(xiàn)有分子診斷技術，且彌補了現(xiàn)有分子診斷技術的部分不足，在臨床應用上具有更廣的適用范圍。此外，在不同類型的臨床樣本中，tHTS也被證明了其在診斷方面的潛能，具體的診斷效力仍需要更多針對性的研究來探索。2．靶向高通量測序對耐藥基因的檢測效力基于培養(yǎng)的藥敏試驗是臨床最常用檢測耐藥細菌的方法，但其過程煩瑣、需要專業(yè)人員解讀結果、靈敏度低。mHTS得到的微生物測序序列數(shù)不足樣本總序列數(shù)的5%，故無法勝任耐藥基因的解讀任務，而基于tHTS的新一代耐藥基因檢測技術將有助于臨床快速檢測耐藥基因。Wu等的研究比較了tHTS與表型藥敏試驗（phenotypicdrugsusceptibilitytesting,DST）對結核耐藥基因檢測的結果。結果顯示，tHTS的靈敏度和特異度分別為97.0％和99.1%，與DST結果高度一致?？梢姡瑃HTS對耐藥基因的檢測具有高度靈敏性。Sibandze等使用tHTS檢測患者的糞便標本并同時進行耐藥性預測。56例結核患者中tHTS檢測出38例（68%)，同時38例陽性患者中的28例(74%）檢測出的結核分枝桿菌復合體耐藥性預測報告，與痰DST結果高度一致（k=0.82)。tHTS在檢測結核分枝桿菌同時可以檢測耐藥基因，極大地縮短了時間。另有研究發(fā)現(xiàn)，結核病患者，tHTS(75.5%）與結核分枝桿菌及利福平耐藥基因檢測（GeneXpertMTB/RIF,Xpert）靈敏度(74.5%）高度一致。因此，在結核的診斷中，tHTS具有一定的指導意義。Patricia等納人了201例支氣管肺泡灌洗液樣本，分別進行mHTS、tHTS及抗菌藥物敏感試驗（antimicrobialsusceptibilitytesting,AST)。結果顯示，mHTS的總體準確性為67.1%,tHTS的總體準確性為65.6%,2種檢測方法具有相似的檢測效力。其中，tHTS檢測出16種具有耐藥標志物的潛在病原微生物，AST檢測出13種可評估表型耐藥性的病原微生物，tHTS檢測出的耐藥表型與藥敏試驗結果的一致率為54.8%。在1例大腸埃希菌與銅綠假單胞菌混合樣本中，藥敏試驗提示大腸埃希菌對美羅培南敏感，而tHTS檢測出BLAOXA基因。銅綠假單胞菌產(chǎn)生BLAOXA基因是本例基因型和表型矛盾的原因。該研究認為，tHTS檢測耐藥基因需要考慮基因的突變、耐藥表型和基因型，以制定更完善的結果解讀方法?？傊F(xiàn)有的基于tHTS的耐藥基因檢測技術靈敏度不弱于傳統(tǒng)方法，且適用于多種標本。未來隨著tHTS的，該技術將部分取代傳統(tǒng)藥物敏感試驗，在指導臨床用藥方面發(fā)揮重要作用。目前，tHTS還存在一些不足：①tHTS的檢測結果是根據(jù)已知病原體設計的，只能檢測設計目標范圍內的病原體，無法檢測出新發(fā)病原體，在臨床實踐中需要根據(jù)具體的需求設計針對性的病原體譜；②測序前的文庫制備需要大量人工和時間成本，且操作人員需要具有較高的專業(yè)水平。綜上所述，tHTS作為一種新興技術在呼吸系統(tǒng)感染的臨床應用中具有極大的潛能。相較于mHTS,tHTS可以針對臨床初篩需求設計檢測范圍，覆蓋常見病原體、簡化解讀流程、靶向擴增針對性提高病原體的檢出可信度。未來，隨著tHTS的發(fā)展，其應用有望得到更大的拓展。
《小兒霧化全知道：讓寶寶呼吸更順暢》在兒童的健康護理中，小兒霧化治療是一種常見且有效的手段。本文將全面介紹小兒霧化，幫助家長更好地了解這一治療方式，為寶寶的呼吸健康保駕護航。一、什么是小兒霧化？小兒霧化治療是通過霧化裝置將藥物分散成微小的霧滴或微粒，使其懸浮于氣體中，并進入呼吸道及肺內，達到潔凈氣道、濕化氣道、局部治療及全身治療的目的。二、小兒霧化的原理霧化治療主要利用了氣體射流原理。霧化器將藥物溶液或混懸液轉化為微小顆粒，這些顆?？梢噪S著患者的呼吸進入呼吸道的不同部位，直接作用于病變部位。三、小兒霧化的適用病癥1.?呼吸道感染：如感冒、咳嗽、支氣管炎、肺炎等。2.?哮喘：霧化治療可以緩解哮喘發(fā)作時的呼吸困難、喘息等癥狀。3.?過敏性咳嗽：對于由過敏引起的咳嗽，霧化可以減輕炎癥反應。4.?喉炎：特別是急性喉炎，霧化可以減輕喉部水腫，緩解聲音嘶啞、犬吠樣咳嗽等癥狀。四、小兒霧化的優(yōu)勢1.?藥物直達病灶：霧化治療可以使藥物直接作用于呼吸道病變部位，提高藥物的局部濃度，增強治療效果。2.?減少副作用：與口服或注射藥物相比，霧化治療的藥物劑量相對較小，減少了全身副作用的發(fā)生。3.?使用方便：小兒霧化治療通?？梢栽诩彝ブ羞M行，操作簡單方便，減少了患兒往返醫(yī)院的麻煩。4.?依從性好：對于年齡較小的寶寶，霧化治療相對容易接受，提高了治療的依從性。五、小兒霧化的注意事項1.?選擇合適的霧化器：應根據(jù)寶寶的年齡、病情選擇合適的霧化器。一般來說，壓縮式霧化器效果較好，但價格相對較高；超聲霧化器價格便宜，但霧化顆粒較大，可能影響治療效果。2.?正確使用霧化器：在使用霧化器前，應仔細閱讀說明書，掌握正確的使用方法。包括如何安裝霧化器、如何調節(jié)霧量、如何清潔霧化器等。3.?選擇合適的藥物：霧化治療的藥物應根據(jù)寶寶的病情由醫(yī)生開具。家長不要自行購買藥物進行霧化治療，以免發(fā)生藥物不良反應。4.?注意霧化時間和頻率：一般來說，每次霧化治療的時間為10-15分鐘，每天可進行2-3次。具體時間和頻率應根據(jù)寶寶的病情和醫(yī)生的建議進行調整。5.?觀察寶寶的反應：在霧化治療過程中，家長應密切觀察寶寶的反應，如出現(xiàn)呼吸困難、面色蒼白、口唇發(fā)紺等異常情況，應立即停止霧化治療，并及時就醫(yī)。6.?做好霧化后的護理：霧化治療后，家長應及時幫助寶寶清潔口腔和面部，以免藥物殘留引起口腔感染。同時，應讓寶寶多喝水，促進痰液排出。六、如何選擇合適的霧化藥物？1.?支氣管擴張劑：如沙丁胺醇、特布他林等，可以緩解支氣管痙攣，改善呼吸困難。2.?糖皮質激素：如布地奈德等，具有抗炎、抗過敏作用，可減輕呼吸道炎癥反應。3.?祛痰藥：如氨溴索等，可以促進痰液排出，改善呼吸道通暢度。七、小兒霧化的誤區(qū)1.?霧化治療時間越長越好：并非如此，過長時間的霧化治療可能會導致寶寶疲勞、不耐受，甚至引起呼吸道黏膜水腫。2.?只要咳嗽就做霧化：霧化治療應根據(jù)病情需要進行，不是所有的咳嗽都適合霧化治療。如果寶寶只是輕微咳嗽，沒有其他癥狀，可以先觀察，不必急于進行霧化治療。3.?自行調整藥物劑量：家長不要自行調整霧化藥物的劑量，以免影響治療效果或引起藥物不良反應?？傊红F化治療是一種安全、有效的治療方式，可以幫助寶寶緩解呼吸道疾病的癥狀，讓寶寶呼吸更順暢。家長在使用霧化治療時，應選擇合適的霧化器和藥物，正確使用霧化器，注意觀察寶寶的反應，做好霧化后的護理，避免陷入霧化治療的誤區(qū)。同時，家長還應密切關注寶寶的病情變化，如有需要，及時就醫(yī)。