腸道微生物參與眾多生理功能，越來越多的文獻表明腸道菌群與癌癥相關(guān)，近期Nature上線兩篇重磅文章，一篇是2月27荷蘭烏德勒支研究所Ruben van Boxtel與Hans Clevers合作Nature上線的“Mutational signature incolorectal cancer caused by genotoxic pks+ E. coli” 文章發(fā)現(xiàn)：攜帶pks毒力基因島的大腸桿菌可產(chǎn)生基因毒素colibactin，通過使用腸道微生物產(chǎn)生的colibactin對體外培養(yǎng)的人類腸道干細胞（類器官）進行注射，發(fā)現(xiàn)colibactin或pks+大腸桿菌可以導(dǎo)致基因損傷（單堿基替換和插入缺失）進而造成大腸癌的發(fā)生，該文章揭示了腸道微生物產(chǎn)生的代謝物可直接引起基因突變，從而引起癌變。為預(yù)防和治療癌癥提供研究基礎(chǔ)和新的可能。 文章分析了33種癌癥的全基因組和全轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)（1萬患者，1.8萬樣本），鑒定腫瘤和正常組織以及血液中的微生物DNA和RNA；約7.2%的序列為非人類來源，用機器學習模型鑒定出不同癌癥和組織類型的微生物特征；對于無基因組改變的癌癥，血液微生物DNA（mbDNA）能較好的區(qū)分不同癌癥類型；分析69例健康人和100例癌癥患者證實，mbDNA能用來區(qū)分健康人和癌癥患者以及不同癌癥類型。 該文章首次利用AI預(yù)測腫瘤組織微生物，并表明微生物可作為癌癥預(yù)測的指標，從血液看癌癥，并非不可能。 Nature同期還發(fā)布了該文章的評論文章，該研究的重要性和意義，不言而喻。 如果說以上兩篇文章暗示了在腫瘤微環(huán)境中可能存在微生物，近期華人學者的這篇作品則是證實了這一假設(shè)。來自芝加哥大學和德克薩斯大學西南醫(yī)學中心的華人學者聯(lián)合在Journal Of Experimental Medicine（JEM,IF:10.892）發(fā)表題為“Intratumoral accumulation of gut microbiota facilitates CD47-based immunotherapy via STING signaling”的論文。文章利用微生物腫瘤內(nèi)注射，發(fā)現(xiàn)腫瘤微環(huán)境的改變可影響基于CD47的免疫療法。 文章背景： 傳統(tǒng)觀點認為腸道菌群對腫瘤的影響主要是通過影響腸道免疫來實現(xiàn)，但微生物是否能直接作用于腫瘤微環(huán)境（TME）尚未被報道。 文章內(nèi)容： 文章首先使用杰克遜實驗室（Jax）和Taconic生物科學（Tac）的WT小鼠進行腫瘤移植，并進行CD47阻滯（抗體治療），Jax小鼠對CD47阻滯有反應(yīng)，而帶有腫瘤的Tac小鼠無反應(yīng)。而當把兩種小鼠共同飼養(yǎng)后，Tac小鼠對CD47阻滯產(chǎn)生反應(yīng)。提示微生物影響免疫治療效果。 進一步研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤越大，腫瘤部位厭氧程度越高，使用雙歧桿菌靜脈注射后，在肺部未檢測到雙歧桿菌，但可在腫瘤部位檢測到，雖然單獨使用雙歧桿菌不影響腫瘤生長，卻可增強CD47抗體的作用。說明雙歧桿菌的腫瘤靶向能力是腸道菌群影響抗腫瘤反應(yīng)的一種可能機制 文章總結(jié)： 文章通過微生物處理增加免疫治療效果，腫瘤內(nèi)注射益生菌和抗生素加以驗證，之后證明益生菌的作用依賴于IFN-I信號和T細胞，并受STING信號調(diào)節(jié)。 文章邏輯清晰，實驗完整，從科學假設(shè)到實驗論證，環(huán)環(huán)相扣。并顛覆人們常規(guī)認識，證明微生物存在于腫瘤微環(huán)境，并影響免疫療法的抗腫瘤效果。

導(dǎo)讀：自1965年分離出人冠狀病毒至今，共發(fā)現(xiàn)了7種人冠狀病毒可使人類致病。從2003年的SARS-CoV到2019年武漢的新型冠狀病毒SARS-CoV-2，均反映了冠狀病毒領(lǐng)域研究的重要性。由于病毒自身的結(jié)構(gòu)特征及宿主眾多，導(dǎo)致該病毒極易發(fā)生變異，產(chǎn)生新類型的冠狀病毒，給疾病的防治帶來了極大難度。近年來諸多學者對冠狀病毒進行了大量的研究。 1 冠狀病毒概述 冠狀病毒(Coronavirus，常簡寫為CoV)屬套氏病毒目，冠狀病毒科，冠狀病毒屬，為有包膜的正股單鏈RNA病毒，直徑為80~120 nm，約有3萬個堿基組成，其遺傳物質(zhì)是已知RNA病毒中最大的。維持如此大的基因組有賴于其含有大量的3’-5’核糖核酸外切酶(ExoN)，ExoN的結(jié)構(gòu)域在病毒進化和基因組擴展的過程中能夠糾正RNA的復(fù)制錯誤，維持病毒的穩(wěn)定性[1]。冠狀病毒由核衣殼蛋白（N蛋白）、受體結(jié)合位點的刺突糖蛋白（S蛋白）、小包膜糖蛋白（E蛋白）、負責運輸營養(yǎng)物質(zhì)的膜糖蛋白（M蛋白）、血凝素糖蛋白（HE蛋白）及核糖核酸（RNA）構(gòu)成。國際病毒分類命名委員會在2012年根據(jù)其遺傳學差異和血清學特性將冠狀病毒分為α、β、γ、δ四群，其中β群冠狀病毒又進一步分為A、B、C、D四個組。α、β兩群易感染哺乳動物，包含了7種對人類致病的冠狀病毒，分別為HCoV-OC43、HCoV-229E、SARS-CoV、HCoV-NL63、HCoV-HKU1、MERS-CoV和SARS-CoV-2；而γ、δ兩群則主要感染禽類。 冠狀病毒是一種常見的、易引發(fā)呼吸道疾病的病原體。在引起成人社區(qū)獲得性肺炎的病毒中，冠狀病毒檢出率與其他呼吸道病毒的檢出率相似[2]。其整個感染過程包括吸附入侵、基因合成、成熟病毒包裝和病毒釋放４個步驟。病毒的吸附入侵取決于病毒受體的特異性，此過程主要依靠病毒的刺突蛋白（S蛋白）。S蛋白屬于Ⅰ型跨膜糖蛋白，可分為兩個結(jié)構(gòu)域：受體結(jié)合亞基S1和膜融合亞基S2，在病毒入侵過程中，S1負責與宿主細胞表面的受體結(jié)合，然后病毒進行附著，S2負責融合宿主和病毒的細胞膜，使病毒基因組進入宿主細胞[3]，從而形成穩(wěn)定的結(jié)合物，達到感染宿主細胞的目的。 2冠狀病毒感染的臨床表現(xiàn)與感染途徑 目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)7種致病性人冠狀病毒，它們能感染人類、牲畜和許多其他野生動物的呼吸系統(tǒng)、胃腸道、肝臟和中樞神經(jīng)系統(tǒng)[4]。其中SARS-CoV、MERS-CoV曾在人群中大范圍傳播流行，證明了冠狀病毒在動物間、人與人之間傳播的可能性[5]。研究表明，蝙蝠身上能攜帶超過100多種病毒，是許多高致病性病毒的天然宿主，如狂犬病毒、埃博拉病毒、馬爾堡病毒等，對人類社會造成巨大威脅的SARS-CoV正是來自中華菊頭蝠[6]。在中國云南的野外蝙蝠群體中寄生了很多種SARS樣冠狀病毒，這些病毒的基因重組，隨時可能導(dǎo)致下一次“SARS疫情”的發(fā)生[7]。2019年武漢疫情中發(fā)現(xiàn)的SARS-CoV-2就屬于蝙蝠SARS樣冠狀病毒和中東呼吸綜合征冠狀病毒的病毒群，根據(jù)冠狀病毒的系統(tǒng)發(fā)生樹，SARS-CoV-2與bat-SL-CoVZC45（同源性達85%以上）關(guān)系密切[8]。研究顯示，蝙蝠攜帶的SARS樣冠狀病毒除了可利用來自人類、果子貍及中華菊頭蝠的血管緊張素轉(zhuǎn)換酶Ⅱ（ACE2）受體之外，還可利用來自浣熊狗ACE2受體分子入侵細胞。這意味著將有更多種的傳播途徑跨宿主感染人類[9]。同時，數(shù)據(jù)顯示ACE2不僅在肺AT2細胞中高表達，也在回腸和結(jié)腸的吸收腸上皮細胞中表達。因此，消化系統(tǒng)是SARS-CoV-2除了呼吸系統(tǒng)外存在的另一條潛在傳播途徑[10]。除了呼吸道、消化道傳播途徑外，家庭聚集性傳播也是很重要的影響因素，有研究報告了1例1戶7人家庭中6人都罹患新型冠狀病毒肺炎（COVID-19）的案例，提示此新型冠狀病毒具備人傳人的能力[11]。由于SARS-CoV的S蛋白和M蛋白具有極強的變異性，這為跨物種傳播提供了重要的物質(zhì)基礎(chǔ)[12]，該病毒對于外界的抵抗能力和穩(wěn)定性也強于一般的人冠狀病毒。MERS-CoV的中間宿主則是單峰駱駝，有20%的病例是由于患者接觸單峰駱駝所導(dǎo)致的[13]。除飛沫、直接接觸傳播之外，袁國勇教授的課題組用大量的實驗數(shù)據(jù)證明，糞-口傳播無論是在駱駝傳染人類還是人類之間的相互傳染中都是一條重要的MESR-CoV傳播新途徑[14]。 7種致病性人冠狀病毒中HCoV-OC43、HCoV-229E、HCoV-NL63、HCoV-HKU1主要引起相對溫和的急性上呼吸道感染癥狀，如咳嗽、發(fā)熱、咽喉痛、流鼻涕等，患者起病癥狀輕微，可無發(fā)熱癥狀，多數(shù)患者為輕、中度，預(yù)后良好。有研究表明，HCoV-HKU1易感染免疫力低下人群，如老人、兒童，尤其是患有基礎(chǔ)疾病的患者常因病情加重而住院[15]。而SARS-CoV、MERS-CoV、2019-nCoV這3種病毒引起的病癥則較為嚴重，在有原發(fā)疾病的前提下，會引起更嚴重的呼吸系統(tǒng)疾病，如急性呼吸窘迫綜合征[8]。由于SARS-CoV和SARS-CoV-2都是以其他生物的ACE2為受體以達到感染宿主的目的[16]，而ACEⅡ主要位于人肺部深處的肺細胞上，因此更易引發(fā)肺炎等重癥疾病。MERS-CoV的識別受體則為DPP4（二肽激肽酶-4），DPP4受體細胞在下呼吸道中比較常見，在上呼吸道比較少見，就能解釋病毒為何更易導(dǎo)致肺部病變而不像一般感冒病毒那樣僅侵犯鼻咽部。SARS-CoV-2與SARS-CoV臨床癥狀極為相似，均會引起患者高熱、咳嗽、進行性呼吸困難及低血氧癥等癥狀，而胃腸道癥狀比較少見。研究表明只有43.8%的SARS-CoV-2感染者入院時存在發(fā)燒的現(xiàn)象，87.9%則在住院后出現(xiàn)發(fā)熱癥狀[17]，因此，早期診斷時發(fā)熱并不能作為篩查標準，應(yīng)結(jié)合CT檢查結(jié)果和其他臨床癥狀進行綜合判斷。組織病理學檢查中，患者肺部病變常表現(xiàn)為非特異性炎癥反應(yīng)，肺泡上皮細胞嚴重脫落、肺泡間隔增寬，肺間質(zhì)小動脈壁的損傷，表明炎癥反應(yīng)在整個疾病過程中起著重要作用，患者可因呼吸衰竭而死亡。MERS-CoV是繼SARS后的又一種能引發(fā)人類嚴重呼吸道感染甚至致死的病原體，病例多集中在中東地區(qū)，MERS-CoV感染可產(chǎn)生高熱、寒戰(zhàn)、咳嗽、肌肉酸痛等癥狀，部分伴有腹瀉腹痛、惡心嘔吐等消化道癥狀，重癥病例可在肺炎的基礎(chǔ)上伴有其他并發(fā)癥，如肝、腎衰竭等,這可能與MERS-CoV的受體DPP4在人體中分布較為廣泛有關(guān)。與SARS-CoV患者相比，MERS-CoV患者的病死率更高,因為該病毒可感染患者體內(nèi)的T淋巴細胞并誘導(dǎo)其凋亡；而SARS-CoV的受體為ACE2，且其在患者體內(nèi)的表達量較少，因此SARS-CoV不會感染T淋巴細胞[18]。 3冠狀病毒的檢測 目前冠狀病毒的檢測主要有兩個發(fā)展趨勢：方法的多樣性和多種方法互補聯(lián)合使用。冠狀病毒的主要檢測方法有細胞培養(yǎng)、血清學檢測、核酸檢測、電鏡檢測等，具體介紹如下。 3.1細胞培養(yǎng) 傳統(tǒng)的細胞分離培養(yǎng)是在體外模擬體內(nèi)環(huán)境獲得大量細胞的過程，37 ℃模擬人體環(huán)境，待75％的細胞發(fā)生病變后，凍融細胞3次獲得病毒?？衫梅侵藓锬I傳代細胞(VERO E6)來培養(yǎng)SARS患者血液、糞便和呼吸道分泌物標本中的病毒[19]。細胞培養(yǎng)的優(yōu)點：此法是病毒檢測的金標準，能順利進行下一步對細胞的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、合成代謝等特性的研究；缺點：多數(shù)細胞培養(yǎng)出現(xiàn)病變需要5–10天[19]，培養(yǎng)周期長，靈敏度低且不易觀察，不能用于快速診斷，因此不能作為首選的檢測手段。 2血清學檢測 目前血清學檢測法包括免疫層析法、酶聯(lián)免疫吸附實驗等[20]。 抗原、抗體檢測是臨床常用的初篩方法，例如免疫層析法和利用MERS-CoV的N蛋白建立的雙抗體夾心ELISA法[21]，通過采集患者標本與已知抗體發(fā)生特異性結(jié)合來檢測抗原。國際上常用的抗體檢測方法是酶聯(lián)吸附實驗，在抗原抗體結(jié)合反應(yīng)的基礎(chǔ)上，利用酶催化和信號放大作用，借助光學儀器進行病毒陰、陽性的判斷。目前已有公司針對SARS-CoV-2研制出了POCT快速檢測試劑盒，運用免疫膠體金層析技術(shù)對患者血清或全血樣本中的病毒IgM/IgG抗體進行體外定性檢測，可在15 min內(nèi)得到結(jié)果。該方法的優(yōu)點：試劑盒易于標準化和商品化，具有操作方便、快捷的特點，適用于隱性感染及大規(guī)模人群的篩查。同時，血清學檢測不僅能作為感染診斷依據(jù)，還可以用于體內(nèi)特異性抗體的變化監(jiān)測和既往感染規(guī)律、人群易感程度等流行病學數(shù)據(jù)研究，為疾病的防治與疫苗研發(fā)提供參考依據(jù)。缺點：需要已知的特異抗原、抗體成分，而病毒種類繁多，難以完全滿足抗原、抗體需求。而且從病毒的感染到抗體的產(chǎn)生存在窗口期，容易出現(xiàn)假陰性，檢測靈敏度相對較低。 3核酸檢測 核酸分子檢測具有靈敏度高、特異性強的特點，已成為冠狀病毒檢測的主流方法，目前對檢測區(qū)域的篩選和基因變異的分析是研究的重點，尤其是針對SARS-CoV、MERS-CoV這種具有巨大社會危害性的傳染性病毒。 針對病毒核酸的檢測，普遍應(yīng)用的方法是實時熒光定量PCR法。它通過對標本中的特定核酸序列進行擴增獲得足夠的核酸數(shù)量后，通過熒光等常規(guī)方法進行檢測[22]。除此之外，目前有研究基于Tn5轉(zhuǎn)染體具有直接分解RNA/DNA異源復(fù)合體的能力開發(fā)了一種轉(zhuǎn)錄組測序快速建庫方法——SHERRY（Sequencing HEteRo RNA-DNA-hYbrid）[23]，與已有的其他方法相比，其建庫的過程更簡單，樣品的用量更少，不僅可以用于高質(zhì)量的單細胞轉(zhuǎn)錄組測序，也可以用于目前正在肆意蔓延的SARS-CoV-2病毒的檢測。牛培華等[24]在2014年建立了一種實時熒光定量PCR毛細管電泳儀，單管內(nèi)同時實現(xiàn)檢測6種人類冠狀病毒的檢測，該檢測方法具有良好的特異性與靈敏度。耿合員等[25]發(fā)明了一種四重熒光定量檢測試劑盒，能夠同時檢測HCoV-229E、HCoV-NL63、HCoV-OC43和HCoV-HKUI4種病毒，具有良好的檢測效果。這些試劑盒的出現(xiàn)使病毒的檢測更加的方便、高效，但是目前SARS-CoV-2病毒PCR試劑盒的檢測性能不盡如人意，據(jù)2020年1月30日《人民日報》報道，天津1例新型冠狀病毒患者，經(jīng)4次核酸檢測后才顯示核酸結(jié)果陽性[26]。有學者認為導(dǎo)致其陽性率低的因素有很多[22,27]，包括標本運輸及采樣不規(guī)范，核酸提取質(zhì)量的差別，不同試劑盒之間的差異，擴增儀器的精密度，以及對于該病毒了解認知較缺乏和無法進行定標質(zhì)控等多方面因素，但并不能否定核酸檢測對于新型冠狀病毒肺炎的價值，國家衛(wèi)健委公布的《新型冠狀病毒感染的肺炎診療方案（試行第五版）中，核酸檢測仍是確診指標[28]。 3.4電鏡檢測 需要與其他方法相結(jié)合才能將電鏡觀察的優(yōu)勢最大化，如人類呼吸道病原體在人呼吸道上皮細胞培養(yǎng)基上繁殖后，與電子顯微鏡觀察和全基因組測序相結(jié)合，能成功地檢測出新型人冠狀病毒，并將其可視化。在此基礎(chǔ)上，研究者獲得了三個基因組，進一步設(shè)計了針對2019-nCoV基因組ORF1ab、n和e區(qū)的特異、靈敏的檢測方法[29]，用于檢測臨床標本中的病毒RNA。電子顯微鏡法的優(yōu)點：可直接觀察到病毒形態(tài)；缺點：需要先分離出病毒才能在鏡下觀察,且無法確認其基因型。 4冠狀病毒感染患者的治療 對于冠狀病毒感染患者的治療，機制尚不明確，目前尚未研制出特效藥，現(xiàn)有的治療方案以對癥和支持治療為主。最近研究發(fā)現(xiàn)以下幾種藥物對冠狀病毒感染有一定療效。 1 4.1腺苷類似物 腺苷類似物是一種化學合成的嘌呤和嘧啶類似物，在進入受感染細胞后迅速被磷酸化，致使病毒的RNA聚合酶將藥物產(chǎn)生的核苷三磷酸摻入延伸的RNA鏈中，引起鏈延長終止,從而抑制病毒的復(fù)制。目前用于治療慢性和急性病毒感染性疾病。例如BCX4430能夠直接發(fā)揮作用，對包括SARS-CoV和MERS-CoV在內(nèi)的多種RNA病毒具有體外抑制活性[30]。 瑞德西韋（Remdesivir，又稱GS-5734）是一種具有藥理活性的核苷三磷酸，以病毒的RNA聚合酶為靶點，能有效阻止病毒的RNA復(fù)制，目前已證明對MERS-CoV感染的控制有效[31]。有研究顯示該藥物對于感染病毒的恒河猴，能夠提高其生存率達100%[31]。因此GS-5734是一種非常有前景的廣譜抗病毒藥物。目前有研究對利巴韋林、噴昔洛韋、硝唑尼特、萘伐他汀、氯喹、GS-5734和法維匹拉韋對SARS-CoV-2的抗病毒效果進行了分析，結(jié)果提示：GS-5734和氯喹在控制SARS-CoV-2感染方面是非常有效的[32]。 科學家發(fā)現(xiàn)丙型肝炎病毒和冠狀病毒的病毒基因組復(fù)制的機制類似，由此推斷治療丙型肝炎的藥物索福斯布韋/韋爾帕塔斯韋對包括SARS-CoV-2在內(nèi)的冠狀病毒也可能有良好的抑制作用[30]。 2 4.2 萘莫司他 萘莫司他是一種絲氨酸蛋白酶抑制劑[33]，對于S蛋白介導(dǎo)的膜融合，如與跨膜蛋白酶絲氨酸2（TMPRSS2）與S蛋白的融合，具有強力的抑制作用。1%濃度的萘莫司他就能夠有效抑制MERS-CoV的S蛋白介導(dǎo)的膜融合，從而達到阻止病毒感染宿主的目的。 3 4.3通過免疫機制治療 抗病毒藥物治療范圍狹窄，且容易產(chǎn)生耐藥性，因此疫苗和免疫治療是替代抗病毒藥物較好的備選方案，疫苗是防止病毒傳播的最佳保護措施，然而由于疫苗的開發(fā)要耗費大量的金錢時間，難度較大，因此利用先天免疫反應(yīng)系統(tǒng)采取有效的治療措施顯得更加方便、快捷。 冠狀病毒入侵人體免疫系統(tǒng)，感染巨噬細胞并激活分化T細胞后，免疫細胞及組織細胞大量釋放細胞因子用于免疫反應(yīng)擴增。在SARS病人肺間質(zhì)浸潤性炎癥細胞中約有80%是CD8+T細胞，CD8+T細胞具有細胞毒性，能清除感染細胞中的冠狀病毒并誘導(dǎo)免疫損傷[34]，在抵抗病毒感染的過程中發(fā)揮重要作用。而在病毒感染過程中，CD8+T細胞并不會受到SARS-CoV的影響[18]，CD4+T細胞則易受到MERS-CoV感染。還有研究表明[35]，T細胞對S蛋白和其他結(jié)構(gòu)蛋白的反應(yīng)具有持久性，此特點為將來疫苗的開發(fā)提供了良好的突破口。 4 4.4干擾素、抑制劑 干擾素是宿主的主要抗病毒分子，能夠抑制病毒的傳播，發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用，促進巨噬細胞對抗原的吞噬。因此，干擾素的產(chǎn)生對病毒在宿主體內(nèi)能否存活有直接影響[35]。研究發(fā)現(xiàn)應(yīng)用干擾素β1b聯(lián)合霉酚酸對MERS-CoV具有體外抗病毒活性，可以為中東呼吸綜合征患者提供更具針對性的治療方案[36]。 洛匹那韋-利托那韋——一種用于治療艾滋病毒的蛋白酶抑制劑，在體外試驗中也顯示對MERS-CoV有抑制作用[37]。目前針對SARS-CoV-2開展的洛匹那韋和利托那韋聯(lián)合應(yīng)用的隨機對照實驗已經(jīng)在指定醫(yī)院展開，以評估洛匹那韋和利托那韋聯(lián)合應(yīng)用于SARS-CoV-2感染住院患者的療效和安全性。 5 4.5 SARS-CoV-2治療方案 鑒于SARS-CoV-2是一種新出現(xiàn)的病毒，尚未開發(fā)出特效藥，除了應(yīng)有上述提到的抗病毒藥物以外，目前以吸氧和輔助對癥為主，其中38%的患者接受了吸氧治療[17]，輕、中度患者應(yīng)當注意隔離和臥床休息，監(jiān)測各項指標，維持體內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定，留意血氧飽和度變化，根據(jù)相關(guān)實驗室數(shù)據(jù)及時調(diào)整治療方案，例如，有細菌感染出現(xiàn)時要及時給予抗菌治療，但要避免盲目的抗菌藥物治療，尤其是廣譜抗菌藥物的聯(lián)合應(yīng)用要慎重。危重癥病例的治療原則：在對癥治療的基礎(chǔ)上，防止并發(fā)癥和繼發(fā)性感染，并進行器官功能支持，同時，要注意加強患者的心理疏導(dǎo)，避免產(chǎn)生恐懼焦慮等負面情緒影響病情好轉(zhuǎn)。 5 冠狀病毒感染的預(yù)防 針對冠狀病毒的感染，目前尚缺乏有效的疫苗，因此了解其傳播途徑，并采取有效的預(yù)防措施至關(guān)重要。SARS-CoV-2致病性要低于SARS[29]，其死亡病例大多是有原發(fā)疾病且免疫力低下的人群，但其傳播能力極強，有模型預(yù)測，武漢感染患者可能高達75 800例[38]。目前被SARS-CoV-2感染的患者中，約26%的患者是未去過武漢或接觸武漢回來的人員[17]，所以無法排除“超級傳播者”的存在，因此，切斷傳播途徑、保護易感人群是目前能夠控制疫情的最佳方案。SARS-CoV-2與2003年SARS疫情相似，都與出售野味動物和肉類市場有關(guān)[29]，給人們深刻的警示：將來要進一步規(guī)范市場管理，養(yǎng)成良好的生活習慣，一旦出現(xiàn)疫情，應(yīng)及時切斷傳染源，把疫情控制在最小的范圍內(nèi)然后及時將其“消滅”[38]；疫情期間應(yīng)不參加群體類活動，減少外出，防止發(fā)生聚集性感染事件，外出正確佩戴口罩，加強室內(nèi)空氣的流通，勤洗手，保持個人良好的衛(wèi)生習慣，不食用生食，盡量不接觸野生動物，平日里注重鍛煉，增強體質(zhì)和自身免疫力。此外，就醫(yī)時應(yīng)做好防護措施，避免交叉感染，醫(yī)護人員要采取分級防護原則，避免院內(nèi)感染的發(fā)生，上述措施是有助于控制疫情進一步擴散的有效手段。

CRISPR-Cas9基因編輯提供了強大的工具，可增強人類T細胞抵抗癌癥的天然能力。 1 近日，頂尖學術(shù)期刊《科學》（Science）在線發(fā)布了一項癌癥免疫療法的臨床試驗最新進展。其中，研究人員開展了一項首次在人類身上進行的I期臨床試驗，以測試3名難治性癌癥患者中進行CRISPR-Cas9多重編輯以工程改造T細胞的安全性和可行性。 0 研究人員在T細胞中刪除了兩個編碼內(nèi)源性T細胞受體（TCR）鏈的基因TCRα（TRAC）和TCRβ（TRBC），以減少TCR錯配并增強合成的癌癥特異性TCR轉(zhuǎn)基因的表達（NY-ESO- 1）。他們?nèi)コ幋aPD-1（PDCD1）的第3個基因，以提高抗腫瘤免疫力。將工程化的T細胞過繼轉(zhuǎn)移到患者體內(nèi)導(dǎo)致持久移植，并在所有三個基因組位點進行編輯。盡管檢測到染色體易位，但頻率隨時間降低。修飾的T細胞可持續(xù)長達9個月，這表明在這些條件下免疫原性極低，證明了CRISPR基因編輯用于癌癥免疫療法的可行性。 這項研究的共同通訊作者之一是癌癥免疫療法知名科學家、CAR-T細胞療法先驅(qū)Carl June教授。他表示：“首先，我們可以成功地在制備細胞過程中精確地多次編輯，讓細胞在人體內(nèi)的存活時間比過去公布的數(shù)據(jù)更長。其次，目前為止，這些細胞表現(xiàn)出持續(xù)攻擊并殺死腫瘤的能力。” 這一結(jié)果讓基因編輯技術(shù)應(yīng)用于癌癥治療方面展現(xiàn)出了令人期待的潛力，并可能為治療或消除無數(shù)人類遺傳疾病提供希望。 基因編輯的目的是以單堿基對的精度改變細胞的DNA。該原理首先在哺乳動物細胞中得到證實，當時它表明稀有切割核酸內(nèi)切酶的表達可產(chǎn)生雙鏈DNA斷裂，可通過同源和非同源重組進行修復(fù)。然后開發(fā)了多種工程核酸酶以提高效率并實現(xiàn)潛在的治療應(yīng)用，包括鋅指核酸酶、歸巢內(nèi)切核酸酶、轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)核酸酶和CRISPR–Cas9（與Cas9內(nèi)切核酸酶相關(guān)的聚類的規(guī)則間隔的短回文重復(fù)序列）。 使用基因組編輯的第一項人類試驗試驗是在HIV/AIDS患者中進行的，通過靶向白細胞蛋白CCR5，目的是通過非同源重組使基因突變，從而誘導(dǎo)對HIV感染的抵抗力。原則上，在CRISPR–Cas9中整合多個指導(dǎo)序列可在哺乳動物基因組中的多個位點進行多重基因組工程。 CRISPR促進高效多重基因組編輯的能力極大地擴展了可能的靶向遺傳操作的范圍，從而實現(xiàn)了新的可能性，例如在單輪誘變中同時刪除或插入多個DNA序列。使用CRISPR工程來治療多種疾病的前景越來越接近現(xiàn)實，例如遺傳性血液疾病和失明。 CRISPR-Cas9技術(shù)的最新進展還允許在人類T細胞中進行有效的DNA修飾，這對于增強癌癥治療的功效具有廣闊的前景。 T淋巴細胞是專門的免疫細胞，在很大程度上是現(xiàn)代癌癥免疫療法革命的核心。T細胞受體（TCR）復(fù)合物位于T細胞的表面上，并且是通過識別與MHC分子結(jié)合的外來抗原/肽來成功啟動抗腫瘤反應(yīng)的關(guān)鍵。 癌癥免疫療法最有前途的領(lǐng)域之一是過繼細胞療法（adoptive cell therapy）。在這一過程中，患者自身的T細胞經(jīng)過基因工程改造，可以表達可特異性檢測和殺死腫瘤細胞的合成（轉(zhuǎn)基因）TCR。最近的研究表明，對于患有骨髓瘤、黑色素瘤和肉瘤的患者，采用對免疫原性NY-ESO-1腫瘤抗原具有特異性的轉(zhuǎn)基因TCR，這種過繼T細胞轉(zhuǎn)移方法的安全性和有希望的療效。這種方法的局限性在于，轉(zhuǎn)基因TCR已顯示與內(nèi)源TCR的α和β鏈錯配和/或競爭表達。治療性TCRα和β鏈與內(nèi)源性α和β鏈的配對不當會降低治療性TCR細胞表面表達，并可能產(chǎn)生自反應(yīng)性TCR。 過繼轉(zhuǎn)移的T細胞的另一個缺點是誘導(dǎo)T細胞功能障礙或衰竭，導(dǎo)致功效降低。具有轉(zhuǎn)基因TCR的PD-1缺陷同種異體小鼠T細胞顯示出對同種抗原的增強應(yīng)答，表明T細胞上的PD-1蛋白在可能是細胞內(nèi)在的抗原應(yīng)答中起負調(diào)控作用。在患有慢性淋巴細胞性脈絡(luò)膜腦膜炎病毒感染的小鼠中過繼轉(zhuǎn)移PD-1缺陷性T細胞可導(dǎo)致細胞毒性增強，后來導(dǎo)致終末分化T細胞的積累增強。PD-1的抗體阻滯或PD-1編碼基因（即PDCD1）的破壞/敲低，改良的嵌合抗原受體（CAR）或TCR T細胞介導(dǎo)的體外殺傷腫瘤細胞并增強PD-L1 +的清除率體內(nèi)腫瘤異種移植。 但在T細胞療法的基礎(chǔ)上，CRISPR-Cas9基因編輯技術(shù)為增強T細胞的天然抗癌能力進一步提供了強有力的工具。在臨床前研究中，研究人員和其他人發(fā)現(xiàn)，用CAR轉(zhuǎn)導(dǎo)的CRISPR–Cas9介導(dǎo)的人T細胞中PDCD1的破壞增強了異種移植物中的抗腫瘤功效。特異性針對癌癥抗原NY-ESO-1的轉(zhuǎn)基因TCR T細胞與靶向PD-1的單克隆抗體的過繼轉(zhuǎn)移增強了小鼠的抗腫瘤功效。因此，他們設(shè)計了一項首次在人類中進行的I期人類臨床試驗，以測試用于合成生物學癌癥免疫療法應(yīng)用的CRISPR-Cas9基因組多重編輯的安全性和可行性。 在插入TCR之前，研究人員用CRISPR技術(shù)敲除了T細胞內(nèi)的3個基因。其中，兩個是T細胞自帶的TRAC、TRBC和基因，這樣可以避免天然的TCR與基因工程插入的受體產(chǎn)生錯誤配對或競爭，提高治療性TCR的作用。 而第3個基因則是PDCD1靶向T細胞，以增加表達NY-ESO-1 TCR的工程細胞的安全性。原則上，該策略能夠增加外源TCR表達并減少混合異二聚體形成的可能性（即通過分別刪除α和βTCR結(jié)構(gòu)域基因TRAC和TRBC），并限制T細胞衰竭的發(fā)展。由檢查點配體PD-L1和PD-L2觸發(fā)（即刪除PDCD1）。 結(jié)果 以前的研究顯示，這些細胞在幾天內(nèi)就會失去功能，而現(xiàn)在的結(jié)果顯示，經(jīng)過CRISPR編輯的細胞在單次注射后能在相當長的一段時間內(nèi)保持抗癌功能。 臨床方案I期人類試驗（ClinicalTrials.gov NCT03399448）設(shè)計用于評估在CRISPR-Cas9編輯TRAC、TRBC和PDCD1基因座后向患者輸注自體NY-ESO-1 TCR工程T細胞的安全性和可行性。 在制造過程中，將細胞從癌癥患者體內(nèi)取出，進行工程改造，然后再注入人體。經(jīng)基因工程改造的T細胞產(chǎn)物被稱為“ NYCE”（NY-ESO-1轉(zhuǎn)導(dǎo)的CRISPR 3X編輯細胞）。在該協(xié)議的臨床開發(fā)過程中，研究人員們選擇使用TCR而不是CAR，因為使用TCR時細胞因子釋放綜合征的發(fā)生率普遍較低。 原則上，與先前針對轉(zhuǎn)基因TCR的針對NY-ESO-1的臨床試驗中觀察到的不良事件基線較低水平相比，使用Cas9進行基因編輯是否具有潛在的免疫原性或毒性具有更加區(qū)分性的評估。通過慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)工程化自體T細胞，以表達對HLA-A2 * 0201限制性的TCR特異性的NY-ESO-1和LAGE-1中的SLLMWITQC肽。材料和方法部分描述了NYCE T細胞的制造過程、載體設(shè)計和臨床方案，并進行了示意性描述（圖S1和S2）。在最初招募的6名患者中，有4名患者成功改造了T細胞，并按照FDA接受的研究性新藥（IND）申請（表S1）中的規(guī)定進行了詳細的釋放標準測試。 在4名擁有細胞產(chǎn)品的患者中，1位分配了唯一患者編號（UPN）的患者27經(jīng)歷了快速的臨床進展，由于無法滿足協(xié)議規(guī)定的安全標準而不再符合輸液條件（請參閱補充材料）。最后，在3名接受CRISPR-Cas9工程改造T細胞輸注的患者中，2名患者患有難治性晚期骨髓瘤，1名患者患有難治性轉(zhuǎn)移性肉瘤，他們過去接受過的標準療法都顯示無效（表1）。在第-5至-3天（即在給予CRISPR-Cas9工程T細胞給藥之前）對患者進行環(huán)磷酰胺和氟達拉濱的淋巴結(jié)放化療，每天每公斤輸注1×108制造的CRISPR-Cas9工程T細胞協(xié)議的0（圖S2）。沒有向患者施用細胞因子。 也就是說，經(jīng)過這幾重基因編輯的T細胞沒有導(dǎo)致治療相關(guān)的嚴重不良反應(yīng)，并且顯示出了持久的存活和擴增能力。 接受T細胞回輸后，在最長達9個月的時間內(nèi)，患者體內(nèi)仍可以檢測到經(jīng)過基因編輯的工程化T細胞。并且，當研究人員從患者體內(nèi)分離出經(jīng)基因編輯的T細胞，帶回實驗室測試，發(fā)現(xiàn)它們?nèi)杂袣⑺腊┘毎哪芰Α?研究人員們期待，這一項在基因編輯方面的突破性發(fā)現(xiàn)，可以為后期研究提供有用的參考，并且有可能將其擴展到癌癥治療的更多方面