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2021年05月05日
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陳琳副主任醫(yī)師 北京電力醫(yī)院 神經(jīng)外科 我從2003年開始，采用神經(jīng)修復(fù)方案研究和治療肌萎縮側(cè)索硬化（ALS）。這種病也稱為運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元病（MND），2018年5月11日國家衛(wèi)生健康委員會(huì)等5部門聯(lián)合制定了《第一批罕見病目錄》，ALS被收錄其中。病因：病因至今不明。20%的病例可能與遺傳及基因缺陷有關(guān)。另外有部分環(huán)境因素，如重金屬中毒等，都可能造成運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元損害。產(chǎn)生運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元損害的原因，目前主要理論有：1. 神經(jīng)毒性物質(zhì)累積，谷氨酸堆積在神經(jīng)細(xì)胞之間，久而久之，造成神經(jīng)細(xì)胞的損傷。2. 自由基使神經(jīng)細(xì)胞膜受損。3. 神經(jīng)生長因子缺乏。臨床表現(xiàn)：早期癥狀輕微，易與其他疾病混淆?；颊呖赡苤皇歉械接幸恍o力、肉跳、容易疲勞等一些癥狀，漸漸進(jìn)展為全身肌肉萎縮和吞咽困難。最后產(chǎn)生呼吸衰竭。根據(jù)臨床癥狀大致可分為兩型：1. 肢體起病型癥狀首先是四肢肌肉進(jìn)行性萎縮、無力，最后才產(chǎn)生呼吸衰竭。2. 延髓起病型先期出現(xiàn)吞咽、講話困難，很快進(jìn)展為呼吸衰竭。輔助檢查：要早期診斷肌萎縮側(cè)索硬化，除了神經(jīng)科臨床檢查外，還需做肌電圖、神經(jīng)傳導(dǎo)速度檢測(cè)、血清特殊抗體檢查、腰穿腦脊液檢查、影像學(xué)檢查，肌肉活檢。藥物治療：推薦先必新（依達(dá)拉奉右莰醇注射用濃溶液），國家一類新藥。目前，依達(dá)拉奉在日本、韓國、美國、加拿大、中國均已獲批治療ALS適應(yīng)癥。作用機(jī)制：清除自由基，抑制炎癥反應(yīng)，抑制谷氨酸興奮性毒性。適應(yīng)癥：1. 用于改善急性缺血性腦卒中所致的神經(jīng)癥狀，日常生活活動(dòng)能力和功能障礙。2. 抑制肌萎縮側(cè)索硬化（ALS）所致功能障礙的進(jìn)展。用法：每日1次，共30ml（6支），分兩個(gè)15ml（3支），分別用100ml生理鹽水稀釋滴注，每個(gè)15ml滴注30分鐘，連續(xù)滴注。療程：本品給藥期與停藥期組合的28天為一個(gè)周期，共6個(gè)周期（第一周期在連續(xù)給藥14天，之后停藥14天；自第二周期起在14天內(nèi)給藥10天（5天/周）；之后停藥14日，以此重復(fù)（第2-第6周期）。實(shí)際使用，可以根據(jù)醫(yī)生建議，調(diào)整劑量。主診醫(yī)師：陳琳博士。每周五下午專家門診（北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院門診二樓腦病三科神經(jīng)外科門診）。因有時(shí)外出，敬請(qǐng)關(guān)注好大夫網(wǎng)站首頁的“陳琳大夫的門診時(shí)間”http://chenlinbeijing.haodf.com/主治：面肌痙攣，面癱/連帶運(yùn)動(dòng)，三叉神經(jīng)痛，舌咽神經(jīng)痛，眼肌痙攣（Meige綜合征），腦出血，腦梗死，腦血管疾?。i動(dòng)脈狹窄等），腦積水，帕金森病，頸椎病，腰椎間盤突出，腰椎管狹窄，脊髓腫瘤，脊髓栓系，顱內(nèi)腫瘤，腦外傷顱骨缺損，運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元?。ˋLS）。傳承創(chuàng)新，求實(shí)善行東直門醫(yī)院腦病中心神經(jīng)外科全體醫(yī)護(hù)人員將竭誠為您服務(wù)！2020年10月07日23119
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王夢(mèng)陽主任醫(yī)師 醫(yī)生集團(tuán)-北京 神經(jīng)內(nèi)科 肌萎縮側(cè)索硬化癥(ALS)是一種不能治愈的神經(jīng)退行性疾病，其病因是運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元線粒體改變，導(dǎo)致神經(jīng)元進(jìn)行性死亡。雖然ALS的特征是巨大的氧化應(yīng)激，但已觀察到地中海飲食具有較高的抗氧化能力。因此，本研究的目的是確定地中海飲食如何改善線粒體活性，確定特定營養(yǎng)物質(zhì)，此外，觀察與實(shí)現(xiàn)這種改善的疾病相關(guān)的致病機(jī)制。為此，使用PubMed對(duì)文獻(xiàn)進(jìn)行了全面綜述。已觀察到KB具有神經(jīng)保護(hù)作用，可改善能量平衡，增加存活率和運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元數(shù)量。這種酮體生成可以在遵循地中海飲食后實(shí)現(xiàn)，這與其他神經(jīng)退行性疾?。ㄈ绨柎暮Ｄ?、帕金森病和ALS）的巨大獲益相關(guān)。這些益處是由于其較高的抗氧化能力，尤其是基于主要存在于橄欖油、葡萄酒、堅(jiān)果或漿果中的多酚?？傊?，KB可被認(rèn)為是ALS治療的一種有前景的選擇，通過提供神經(jīng)保護(hù)，代表運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元中葡萄糖的替代來源。此外，由于地中海飲食具有較高的抗氧化特性，可改善酮癥生成（KB增加），同時(shí)改善疾病的高氧化應(yīng)激。2020年08月15日1293
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李曉光主任醫(yī)師 北京協(xié)和醫(yī)院 神經(jīng)科 肌萎縮側(cè)索硬化百問百答 Q0，如何全面管理肌萎縮側(cè)索硬化？如何提高患者生活質(zhì)量，延緩患者疾病進(jìn)展。 聽到運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元病診斷，患者及家人大多不甘心，但隨著疾病的逐漸加重，開始了解、接受該病的診斷。 心態(tài)穩(wěn)定下來，要考慮具體要應(yīng)對(duì)的問題就是，既然得了運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元病，該怎么辦呢？如何讓患者存活更長，減少疾病過程的痛苦？ 首先，要多了解運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元病的相關(guān)知識(shí)，準(zhǔn)確獲得疾病相關(guān)信息，無論診斷及治療都會(huì)少走彎路。 其次，一定要意識(shí)到，ALS是一種影響患者整個(gè)家庭生活的疾病，需要全程管理，患者和家人都須和該病長期共處，家人的參與至關(guān)重要。 患者或家人必需知道該病的六個(gè)方面，簡單講就是2020年02月06日32
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王麗平主任醫(yī)師 北醫(yī)三院 神經(jīng)內(nèi)科 熊去氧膽酸熊去氧膽酸是一種親水性膽酸——中藥熊膽中的主要成分，是目前治療原發(fā)性膽汁性肝硬化主要的、也是唯一通過美國FDA審批的藥物，還被廣泛用于治療包括原發(fā)性硬化性膽管炎和進(jìn)行性家族性肝內(nèi)膽汁淤積等在內(nèi)的膽汁淤積型肝臟疾病。熊去氧膽酸及其衍生化合物?；撬嵝苋パ跄懰?，可以通過穩(wěn)定線粒體內(nèi)膜、調(diào)控細(xì)胞凋亡途徑上游靶標(biāo)的表達(dá)、抑制細(xì)胞凋亡途徑最上游的半胱天冬酶的激活等作用來抑制細(xì)胞凋亡，盡管其具體的作用機(jī)理尚不十分清楚。熊去氧膽酸所具有的抗細(xì)胞凋亡、免疫調(diào)節(jié)和抗氧化等作用可能被用于治療ALS，但是用于治療肝臟疾病的熊去氧膽酸膠囊或片劑含有酸性晶體，在酸性環(huán)境中溶解度極低，最終只能在小腸中經(jīng)被動(dòng)的非離子擴(kuò)散被稀釋和吸收，而且大部分會(huì)在肝臟中與甘氨酸或?；撬峤Y(jié)合后隨膽汁排出，因此很難進(jìn)入中樞神經(jīng)系統(tǒng)。后來開發(fā)的熊去氧膽酸口服增溶劑型可以克服這些缺點(diǎn)，使熊去氧膽酸可以高效地進(jìn)入到腦脊液中，為其治療ALS創(chuàng)造了機(jī)遇。早先的一項(xiàng)來自明尼蘇達(dá)大學(xué)醫(yī)學(xué)院的研究結(jié)果顯示，口服劑型的熊去氧膽酸可以通過血腦屏障進(jìn)入ALS患者的腦脊液中。熊去氧膽酸治療ALS的III期臨床試驗(yàn)起始于2005年3月，結(jié)束于2007年7月，試驗(yàn)為單中心、雙盲、隨機(jī)、交叉分組、安慰劑對(duì)照。共有80位ALS患者參加了試驗(yàn)，應(yīng)試患者需滿足以下條件：年齡>=20歲；發(fā)病=<5年；Appel量表指數(shù)在40~120之間；肺功能>=30%；可能或確定的散發(fā)性ALS患者。試驗(yàn)設(shè)計(jì)為交叉分組：先經(jīng)過1個(gè)月的導(dǎo)入期；然后A組服藥3個(gè)月，每天服用3.5克熊去氧膽酸/140毫升，B組服用安慰劑；之后為1個(gè)月的洗脫期；然后進(jìn)行交叉——A組服用安慰劑，B組服藥。對(duì)于這樣的小樣本數(shù)量臨床試驗(yàn)，采用交叉分組相對(duì)于傳統(tǒng)的平行分組的一個(gè)主要優(yōu)勢(shì)是，交叉分組方案可以盡可能地減小應(yīng)試患者人群內(nèi)部的系統(tǒng)誤差。研究者采用交叉分組的另一個(gè)原因是出于醫(yī)學(xué)倫理考慮——通俗地講，就是陽光普照、來者有份兒，任何一個(gè)參加試驗(yàn)的應(yīng)試患者都可以接受熊去氧膽酸的治療。當(dāng)然，這是建立在確信熊去氧膽酸對(duì)ALS患者具有正效果的基礎(chǔ)上的——如果熊去氧膽酸對(duì)ALS患者具有負(fù)效果，那么到頭來誰也跑不掉。在80位ALS應(yīng)試患者中，最后A組有13位、B組有6位患者最終完成了試驗(yàn)；完成試驗(yàn)的應(yīng)試患者共有19位，不足起始時(shí)人數(shù)的四分之一。應(yīng)試患者極高流失率的原因包括：不符合統(tǒng)計(jì)分析條件，失去聯(lián)系，不能按時(shí)隨訪，病情迅速惡化和因不良反應(yīng)退出試驗(yàn)等。主要的不良藥物反應(yīng)均為消化道反應(yīng)，包括腹痛、神經(jīng)性厭食、腹瀉和嘔吐等。研究者認(rèn)為應(yīng)試患者基本上可以耐受熊去氧膽酸，但是患有急性膽囊炎或膽管阻塞等肝膽疾病的ALS患者，使用熊去氧膽酸時(shí)應(yīng)抱有特別謹(jǐn)慎的態(tài)度，遵醫(yī)囑服用。在8個(gè)月的試驗(yàn)期內(nèi)，應(yīng)試患者共接受了4次終點(diǎn)事件檢測(cè)。該項(xiàng)III期臨床試驗(yàn)的結(jié)果顯示，應(yīng)試患者ALS病情指數(shù)和肺功能的變化，在熊去氧膽酸服藥組和安慰劑對(duì)照組之間沒有顯著差異，說明熊去氧膽酸對(duì)治療ALS無效。但是和對(duì)照相比較，熊去氧膽酸服藥組應(yīng)試患者Appel量表指數(shù)下降減緩了1.17點(diǎn)/月，說明熊去氧膽酸在該檢測(cè)指標(biāo)上可以減緩ALS應(yīng)試患者的病情發(fā)展速率。在抽檢的應(yīng)試患者的腦脊液中均檢測(cè)出了熊去氧膽酸的含量。研究者也承認(rèn)，這是一項(xiàng)總體質(zhì)量較差、可信度較低的臨床試驗(yàn)，根本無法得出確定的結(jié)論；除了應(yīng)試患者人數(shù)較少、熊去氧膽酸服藥時(shí)間較短和終點(diǎn)事件檢測(cè)時(shí)間點(diǎn)較少等顯而易見的因素外，最主要的問題就是極高的應(yīng)試患者流失率。研究者在報(bào)告中指出，導(dǎo)致大量應(yīng)試患者紛紛退出試驗(yàn)的一個(gè)主要原因是因?yàn)檫@些患者的病情發(fā)展加快，因此不愿意再繼續(xù)服藥。同時(shí)，本著誠實(shí)的態(tài)度，研究者也強(qiáng)調(diào)了16名應(yīng)試ALS患者服用熊去氧膽酸后病情發(fā)展顯著加快（大于8點(diǎn)/月），而這些患者的試驗(yàn)數(shù)據(jù)被最終排除在統(tǒng)計(jì)結(jié)果之外！因此，綜合考慮以上兩點(diǎn)的話，熊去氧膽酸在該項(xiàng)III期臨床試驗(yàn)中對(duì)ALS的療效肯定會(huì)更加悲觀。該項(xiàng)臨床試驗(yàn)未在美國FDA登記，熊去氧膽酸使用在ALS治療上也未經(jīng)過美國FDA批準(zhǔn)；其研究結(jié)果于2012年發(fā)表在《韓國醫(yī)學(xué)雜志》上。?；撬嵝苋パ跄懰嵯啾容^熊去氧膽酸，對(duì)牛磺酸熊去氧膽酸的研究就要多得多。牛磺酸熊去氧膽酸也是一種親水性膽酸，是熊去氧膽酸在人體肝臟中與?；撬嵯嘟Y(jié)合的內(nèi)源性產(chǎn)物，被廣泛用于治療慢性膽汁淤積型肝臟疾病及膽結(jié)石等。?；撬嵝苋パ跄懰徇€在帕金森癥、亨廷頓癥、阿爾茨海默癥、缺血性和出血性腦卒中等疾病的動(dòng)物模型中展現(xiàn)出神經(jīng)保護(hù)功能，相關(guān)體內(nèi)和體外試驗(yàn)都顯示出?；撬嵝苋パ跄懰嵩谝约?xì)胞凋亡為病理特征的急性和慢性退行性神經(jīng)病變中的抗細(xì)胞凋亡作用——?；撬嵝苋パ跄懰岬倪@些特性暗示其可能被用于治療ALS。?；撬嵝苋パ跄懰嶂委烝LS的II期臨床試驗(yàn)為慈善組織資助，非商業(yè)組織行為。試驗(yàn)開始于2008年6月，結(jié)束于2012年4月，為三中心、雙盲、隨機(jī)、平行分組、安慰劑對(duì)照。共有34位ALS患者參加了試驗(yàn)，其中29位應(yīng)試患者（15位?；撬嵝苋パ跄懰岱幗M和14位安慰劑對(duì)照組）最終完成了試驗(yàn)。應(yīng)試患者需滿足以下條件：年齡18~75歲；發(fā)病=<1.5年；肺功能>=75%；服用利魯唑；四肢起??；可能或確定的ALS患者。試驗(yàn)方案為：先經(jīng)過3個(gè)月的導(dǎo)入期；然后應(yīng)試患者服藥1年，每天2次、每次1克牛磺酸熊去氧膽酸；每1.5個(gè)月進(jìn)行一次病情監(jiān)測(cè)。該項(xiàng)臨床試驗(yàn)的主要終點(diǎn)事件為藥物響應(yīng)者（對(duì)比導(dǎo)入期，ALS病情指數(shù)的變化斜率改善至少15%）的百分比，次要終點(diǎn)事件包括和安慰劑對(duì)照相比較的療效（ALS病情指數(shù)和肺功能等的變化）、應(yīng)試患者生存期和不良反應(yīng)等。試驗(yàn)結(jié)果顯示，牛磺酸熊去氧膽酸可以被應(yīng)試ALS患者耐受，不良反應(yīng)在兩組之間沒有顯著差異；主要的不良藥物反應(yīng)均為消化道反應(yīng)，其發(fā)生幾率與以往牛磺酸熊去氧膽酸治療肝膽疾病的臨床試驗(yàn)中相仿。在該項(xiàng)III期臨床試驗(yàn)的療效結(jié)果中，藥物響應(yīng)者百分比為：服藥組87%，對(duì)照組43%（P=0.021）；在試驗(yàn)結(jié)束時(shí)，相對(duì)基線校正后的ALS病情指數(shù)為：服藥組23.3，對(duì)照組16.3（P=0.007）；說明?；撬嵝苋パ跄懰峥赡苎泳廇LS患者的病情發(fā)展。就ALS病情指數(shù)的4個(gè)分項(xiàng)：下肢運(yùn)動(dòng)、上肢運(yùn)動(dòng)和呼吸功能的變化在兩組之間沒有顯著差異；而對(duì)于球部功能的病情發(fā)展而言，服藥組顯著慢于對(duì)照組。但是肺功能的變化在兩組之間沒有顯著差異。在試驗(yàn)結(jié)束后66周的隨訪結(jié)果顯示，應(yīng)試患者的平均生存期為：服藥組65.7周，對(duì)照組61.1周。經(jīng)過換算，聯(lián)合服用利魯唑和?；撬嵝苋パ跄懰?年可以延緩ALS患者病情發(fā)展約4~5個(gè)月。該項(xiàng)研究成果于2015年發(fā)表在《歐洲神經(jīng)學(xué)雜志》上。從以上兩項(xiàng)臨床試驗(yàn)的結(jié)果來看，?；撬嵝苋パ跄懰釋?duì)ALS的療效似乎比熊去氧膽酸更樂觀一些。在美國FDA的臨床試驗(yàn)數(shù)據(jù)庫中，針對(duì)治療ALS尚沒有任何熊去氧膽酸的臨床試驗(yàn)做過登記，但是已經(jīng)登記了4項(xiàng)?；撬嵝苋パ跄懰岬呐R床試驗(yàn)；這么看來，應(yīng)用牛磺酸熊去氧膽酸治療ALS的臨床研究似乎更活躍一些。這4項(xiàng)臨床試驗(yàn)的基本情況如下：1、意大利IRCCS基金會(huì)卡洛貝斯塔神經(jīng)學(xué)研究所（上述）2、意大利Humanitas公司試驗(yàn)周期為2019年2月22日至2021年6月30日，試驗(yàn)設(shè)計(jì)為多地、雙盲、隨機(jī)、平行分組、安慰劑對(duì)照、聯(lián)合使用利魯唑和?；撬嵝苋パ跄懰岬腎II期臨床試驗(yàn)，為上述1的后繼臨床試驗(yàn)。將有440位應(yīng)試ALS患者參加，患者要求發(fā)病<=1.5年，體重40公斤以上，肺功能>=70%，不使用呼吸機(jī)，吞咽無障礙（ALS病情指數(shù)分項(xiàng)為滿分），服用利魯唑但不使用依達(dá)拉奉，無膽囊疾病。試驗(yàn)方案為3個(gè)月的導(dǎo)入期后，每天飯后10~15分鐘內(nèi)服用?；撬嵝苋パ跄懰崮z囊2次，每次1克，共服藥1.5年；每3個(gè)月監(jiān)測(cè)一次終點(diǎn)事件指標(biāo)，包括響應(yīng)人數(shù)、存活期、ALS病情指數(shù)、肺功能等生理指標(biāo)，及神經(jīng)纖維水平等分子指標(biāo)。3、美國Amylyx公司試驗(yàn)周期為2017年6月22日至2019年12月，試驗(yàn)設(shè)計(jì)為多地、雙盲、隨機(jī)、安慰劑對(duì)照的II期臨床試驗(yàn)，旨在考察聯(lián)合使用?；撬嵝苋パ跄懰岷捅交∷釋?duì)ALS患者的安全性、以及能否延緩病情的發(fā)展。共有132位應(yīng)試ALS患者參加，患者要求發(fā)病<=1.5年，肺功能>=60%，服用利魯唑與否均可，無膽囊疾病或肝功能低下。試驗(yàn)方案為每天服藥2次，每次服用?；撬嵝苋パ跄懰?克和苯基丁酸3克，共服藥6個(gè)月；檢測(cè)的終點(diǎn)事件指標(biāo)包括不良反應(yīng)、存活期、ALS病情指數(shù)變化、肺功能等生理指標(biāo)，及血液檢測(cè)和醫(yī)學(xué)影像等細(xì)胞分子指標(biāo)。4、美國Amylyx公司試驗(yàn)周期為2018年3月29日至2020年1月1日；該項(xiàng)臨床研究是上述3的后繼試驗(yàn)，旨在考察聯(lián)合使用牛磺酸熊去氧膽酸和苯基丁酸后對(duì)ALS患者的長期安全性和療效，因此試驗(yàn)設(shè)計(jì)為多地、非盲、單組的II期臨床試驗(yàn)。監(jiān)測(cè)對(duì)象為上述3中服藥的應(yīng)試患者，檢測(cè)的終點(diǎn)事件包括長期不良反應(yīng)、ALS病情指數(shù)、肺功能、住院次數(shù)、胃造瘺情況和氣切情況等。甘氨酸熊去氧膽酸熊去氧膽酸僅占人體總膽酸排出量的4%；前面提到過，熊去氧膽酸在肝臟中被轉(zhuǎn)化為?；撬嵝苋パ跄懰岷透拾彼嵝苋パ跄懰幔笳叩霓D(zhuǎn)化量遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于前者。研究顯示，?；撬嵝苋パ跄懰岷透拾彼嵝苋パ跄懰峋哂泻托苋パ跄懰嵯嗤纳窠?jīng)保護(hù)作用，因此一個(gè)葡萄牙的研究組將治療ALS的臨床前試驗(yàn)聚焦在甘氨酸熊去氧膽酸上。該項(xiàng)研究使用了一個(gè)ALS的細(xì)胞模型，即過表達(dá)人類SOD1G93A突變基因的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元樣細(xì)胞系NSC-34，而它是由小鼠的成神經(jīng)細(xì)胞瘤細(xì)胞和分化自小鼠干細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元雜交而來。體外試驗(yàn)結(jié)果顯示，當(dāng)用甘氨酸熊去氧膽酸處理NSC-34時(shí)，NSC-34的ALS病理表型發(fā)生了變化：細(xì)胞質(zhì)中的SOD1包涵體減少了，線粒體損傷減少了，半胱天冬酶-9的激活及細(xì)胞凋亡都下降了；細(xì)胞外的硝酸鹽濃度下降了，金屬蛋白酶-9的激活減少了。這些結(jié)果說明甘氨酸熊去氧膽酸可能被用來保護(hù)運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元、延緩ALS的病情發(fā)展。說不定哪天，甘氨酸熊去氧膽酸也和熊去氧膽酸及?；撬嵝苋パ跄懰嵋黄穑尤氲窖泳廇LS病情發(fā)展的戰(zhàn)隊(duì)中。2019年05月14日7256
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王麗平主任醫(yī)師 北醫(yī)三院 神經(jīng)內(nèi)科 再次感謝Christian給我們帶來的干細(xì)胞治療ALS的信息，希望常在。Christian原創(chuàng)科普：利用人類誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞（iPSC）篩選治療ALS的藥物一ALS肌萎縮側(cè)索硬化癥（ALS）是一種罕見的、遲發(fā)的神經(jīng)退行性病變：大腦和脊髓中的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元由于某種尚不清楚的主要有害因素而遭到破壞并逐漸死亡，因此不能再支配肌肉進(jìn)行自主運(yùn)動(dòng)，進(jìn)而患者逐漸喪失運(yùn)動(dòng)能力，包括由肌肉驅(qū)動(dòng)的語言、吞咽和呼吸能力。1、ALS有多罕見？年發(fā)病率約為十萬分之1.5，普遍率約為十萬分之5。目前的年發(fā)病率和普遍率，全球約為12萬和35萬，歐洲為4988和13500，美國5960和17500，日本約為3000和6000。我國由于醫(yī)療體系和醫(yī)保制度等原因，至今尚無相關(guān)的統(tǒng)計(jì)數(shù)字。2、什么是遲發(fā)性？就是起病時(shí)間較晚。在歐洲和日本，ALS患者的發(fā)病年齡大約在65歲。在我國，北醫(yī)三院統(tǒng)計(jì)發(fā)病的平均年齡為49.8歲，中位生存期為5.9年；北京協(xié)和醫(yī)院統(tǒng)計(jì)發(fā)病的平均年齡約為53歲，實(shí)際平均生存期為2.5年。但在80歲后基本不會(huì)發(fā)病。3、雖然ALS非常罕見，ALS患者的病情卻又具有典型的異質(zhì)性，通俗講就是五花八門，發(fā)病年齡、發(fā)病癥狀、臨床表現(xiàn)、發(fā)展速度、存活時(shí)間、遺傳背景等在不同的患者間存在較高的多樣性。這就為ALS的臨床診斷、基礎(chǔ)研究和藥物開發(fā)提出了極大挑戰(zhàn)。4、ALS分為家族性和散發(fā)性2種。家族性ALS占總發(fā)病率的5-10%，散發(fā)性占90-95%。散發(fā)性ALS的發(fā)病年齡比家族性的小11歲。目前鑒定出和ALS相關(guān)的基因突變已有一百多個(gè)，已發(fā)現(xiàn)導(dǎo)致家族性ALS的突變基因包括C9orf72、SOD1、FUS和TDP-43等，其中C9orf72基因突變占家族性ALS的45%，SOD1占20%。5、值得注意的是，ALS的診斷過程較為復(fù)雜、確診時(shí)間較長，通常需要依賴神經(jīng)科臨床檢查和問診、肌電檢查、以及對(duì)相關(guān)一系列病征相近的疾病的排除等間接手段；不像對(duì)其他疾病的診斷，可以根據(jù)標(biāo)志物生化指標(biāo)、和對(duì)病灶的醫(yī)學(xué)影像及組織活檢等直接證據(jù)。同時(shí)，ALS具有進(jìn)行性，早期發(fā)展較慢、癥狀較輕更增加了早期診斷的難度。6、ALS患者的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元在細(xì)胞和分子水平上的病理表型包括：因活性氧自由基脅迫或活性谷氨酸毒害等因素導(dǎo)致的細(xì)胞死亡、自體免疫反應(yīng)、神經(jīng)炎癥反應(yīng)、神經(jīng)營養(yǎng)因子缺乏、軸突運(yùn)輸缺陷、超興奮性或低興奮性、神經(jīng)肌肉接點(diǎn)功能異常、細(xì)胞核質(zhì)運(yùn)輸功能異常、線粒體功能異常、自體吞噬功能異常、RNA加工錯(cuò)誤和蛋白錯(cuò)誤聚集等。二iPSC本文題目里的第二個(gè)關(guān)鍵詞，就是誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞——iPSC。關(guān)于干細(xì)胞，我在“干細(xì)胞移植技術(shù)治療ALS的臨床研究進(jìn)展”一文中作了比較全面的介紹，在此不再贅述。誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞（iPSC）是干細(xì)胞的一種，它是通過人工啟動(dòng)若干（轉(zhuǎn)錄因子）基因的表達(dá)或使用化合物分子，誘導(dǎo)體細(xì)胞的分化、發(fā)育進(jìn)行重新編程，進(jìn)而獲得的具有類似胚胎早期多能干細(xì)胞分子特性、更新能力和分化潛能的一類多能干細(xì)胞。多能干細(xì)胞可以分化為特異組織的細(xì)胞，但是特異組織的細(xì)胞可以分化為多能干細(xì)胞嗎？答案是否定的，除非對(duì)充分分化的細(xì)胞進(jìn)行化學(xué)或基因表達(dá)的誘導(dǎo)。iPSC之父、2012年諾貝爾獎(jiǎng)獲得者山中伸彌教授通過學(xué)習(xí)胚胎發(fā)育早期的基因表達(dá)情況，利用原創(chuàng)的篩選系統(tǒng)，在引入4個(gè)轉(zhuǎn)錄因子基因的特異性表達(dá)后，首次成功地倒轉(zhuǎn)了細(xì)胞自然發(fā)育的時(shí)鐘，將皮膚細(xì)胞誘導(dǎo)成為具有早期胚胎細(xì)胞性質(zhì)的多能干細(xì)胞。那么，iPSC之于ALS，能夠有何作用？如果將家族性或散發(fā)性ALS患者的體細(xì)胞誘導(dǎo)成為iPSC細(xì)胞系，它可以幫助：1、解析ALS的致病機(jī)理。目前，在ALS中導(dǎo)致運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元受損傷的最主要的因素仍未找到，這極大地阻礙了有效治療ALS的藥物和療法的開發(fā)。將iPSC誘導(dǎo)分化成運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元（iPSC-運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元）及神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞等，在保持穩(wěn)定、清晰的ALS遺傳背景下，重塑微觀上的病理模型，可以在細(xì)胞和分子水平上開展ALS的機(jī)理研究。這是iPSC對(duì)攻克ALS的宏觀作用。在ALS發(fā)病后，目前已發(fā)現(xiàn)對(duì)運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的毒害作用包括：活性谷氨酸積累、氧化脅迫、炎癥反應(yīng)、感染、免疫機(jī)制、蛋白錯(cuò)誤聚集、神經(jīng)纖維功能紊亂、激素失調(diào)、線粒體功能和RNA加工出錯(cuò)、及軸突運(yùn)輸和神經(jīng)肌肉接點(diǎn)出現(xiàn)問題等，但這些可能都是下游表型，而不是最上游、最主要的觸發(fā)因素。這就好似一條凌汛期的大江，如果上游潰壩，下游必將多處受災(zāi)；此時(shí)即便在下游多方施救，也是事倍功半，不及盡早將上游的大壩修復(fù)更有成效。相似地，對(duì)于ALS而言，即便對(duì)再多的下游表型對(duì)癥治療，也是防不勝防，而找到上游起因才是關(guān)鍵。2、找到基因型和表現(xiàn)型之間的對(duì)應(yīng)關(guān)系。來自ALS患者的iPSC具有穩(wěn)定、清晰的基因型；該iPSC-運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元是ALS真實(shí)、有效的體外病理模型，可以在細(xì)胞和分子水平上對(duì)其微觀表現(xiàn)型進(jìn)行觀察、分析，包括細(xì)胞形態(tài)、亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)、生化組成和基因表達(dá)等，為確定ALS致病基因型和在運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元上對(duì)應(yīng)的表現(xiàn)型之間的關(guān)系提供了條件。這一點(diǎn)對(duì)散發(fā)性ALS的基礎(chǔ)研究尤為重要，因?yàn)闊o論是ALS動(dòng)物模型還是胚胎干細(xì)胞系，目前的模式系統(tǒng)都是基于家族性ALS致病基因突變（例如SOD1G93A）的轉(zhuǎn)基因異源過表達(dá)。3、發(fā)現(xiàn)生物標(biāo)志物。簡單講，生物標(biāo)志物就是標(biāo)記某種生理改變的生化指標(biāo)；對(duì)于ALS而言，可以理解為在患者和健康成人之間，以及在患病運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元和健康運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元之間存在著某種特異、靈敏而又穩(wěn)定的差異，這種差異可以被一個(gè)易于測(cè)量的生化指標(biāo)所檢定和評(píng)估，而這個(gè)生化指標(biāo)就是ALS的生物標(biāo)志物。該iPSC-運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元和健康的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元之間經(jīng)轉(zhuǎn)錄組、蛋白組和代謝組比對(duì)后，更容易找到針對(duì)ALS的生物標(biāo)志物，進(jìn)而在ALS的早期診斷、精細(xì)分型、病情分期、療效評(píng)估和藥物篩選等方面發(fā)揮重要作用。4、篩選治療ALS的藥物。這是本文的主要內(nèi)容，因此將在下面詳細(xì)展開。實(shí)際上對(duì)于ALS，iPSC之所以有上述用途，主要是基于以下特點(diǎn)：——豐富的病理模型。前面提到過，雖然ALS非常罕見，從臨床上講卻具有高度的異質(zhì)性；尤其是散發(fā)性ALS，相關(guān)基因突變也是數(shù)量龐大。iPSC最明顯的優(yōu)勢(shì)就在于，理論上可以為每一位確定的ALS患者建立iPSC系，該干細(xì)胞系有著明確的疾病相關(guān)性和遺傳信息。相比較ALS動(dòng)物模型，ALS患者的iPSC系可以給ALS研究者提供更加豐富的病理模型。——微觀的研究對(duì)象。前面提到過，在臨床上ALS主要是通過間接方法進(jìn)行診斷，而ALS的基礎(chǔ)研究主要是基于動(dòng)物模型。相比較，iPSC-運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元?jiǎng)t可以在體外以細(xì)胞為單位進(jìn)行研究，當(dāng)分化為運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元后更容易實(shí)施細(xì)胞和分子水平上的觀察、檢測(cè)和實(shí)驗(yàn)，這對(duì)研究致病機(jī)理、分析微觀表型、發(fā)現(xiàn)生物標(biāo)記物和高通量地篩選小分子藥物都具有非常重要的意義?！鄻拥姆只?xì)胞。iPSC的多能性不容忽視：目前已經(jīng)可以將iPSC誘導(dǎo)分化為上運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元、下運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元、脊髓神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞等神經(jīng)細(xì)胞亞型，這樣一來就可以研究在ALS的致病機(jī)制中，不同神經(jīng)細(xì)胞亞型各自發(fā)揮的作用機(jī)理，以及不同神經(jīng)細(xì)胞亞型之間的動(dòng)態(tài)和互作關(guān)系，甚至可以在體外更好地重現(xiàn)運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的體內(nèi)環(huán)境。iPSC對(duì)于ALS研究也不是沒有缺點(diǎn)。前面提到過，ALS具有遲發(fā)性，而且發(fā)病可能還與特殊的生理和環(huán)境因素有關(guān)；這些和其他ALS病理模型一樣，是iPSC-運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元無法還原的。另外一點(diǎn)就是，iPSC-運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元終究是體外系統(tǒng)，也無法囊括非細(xì)胞自主的病理表型，因此任何相關(guān)的發(fā)現(xiàn)均需與體內(nèi)試驗(yàn)或ALS患者樣本進(jìn)行交互驗(yàn)證。三利用iPSC篩選治療ALS藥物的總述1、基本流程A、確定iPSC的患者來源。家族性或散發(fā)性ALS患者？何種基因型？制備近等基因系對(duì)照？B、確定iPSC的誘導(dǎo)方法和運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的分化方法。是否通過細(xì)胞分選來提高細(xì)胞純度？C、確定藥物篩選的病理表型。細(xì)胞死亡或其他表型？能否通過圖像采集進(jìn)行定量分析？D、確定藥物篩選的操作平臺(tái)。一般基于96或384孔板。能否高通量、全自動(dòng)地進(jìn)行？E、確定小分子化合物文庫。是否為臨床上正在使用的、或正在進(jìn)行臨床試驗(yàn)的藥物？F、確定數(shù)據(jù)分析方法。圖像采集算法和數(shù)據(jù)分析方法一般是客制的。G、確定結(jié)果驗(yàn)證方法。是否使用更多的ALS基因型？是否篩查更多的病理表型？H、最后決定是否進(jìn)入臨床前或臨床試驗(yàn)。2、藥物安全性和藥效藥物的安全性是首要的，不可傷敵八百，自傷一千。小分子化合物對(duì)運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的安全性體現(xiàn)在：無論對(duì)ALS-iPSC-運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元還是對(duì)對(duì)照-iPSC-運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元，都不會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞死亡或?qū)е虏±肀硇偷膼夯?。如果小分子化合物文庫是臨床上正在使用的、或正在進(jìn)行臨床試驗(yàn)的藥物，那么篩選出來的候選藥物的安全性通常是有一定保障的，進(jìn)一步的開發(fā)過程通?？梢允∪ズ芏嘞嚓P(guān)試驗(yàn)——而這部分藥物安全性的試驗(yàn)往往是新藥開發(fā)中最昂貴的部分。至于藥效，指藥物能否改善ALS病理表型指標(biāo)，以及改善的程度。四用iPSC篩選ALS治療藥物的開創(chuàng)性研究和腰果酸的發(fā)現(xiàn)2007年至2018年間，全球共進(jìn)行了86項(xiàng)針對(duì)治療ALS的臨床試驗(yàn)，其中絕大多數(shù)有關(guān)小分子藥物。這些試驗(yàn)或最終完成，或中途終止，但最終卻只有一個(gè)藥物獲得了FDA的批準(zhǔn)，即2017年5月獲準(zhǔn)應(yīng)用于ALS治療的依達(dá)拉奉。這些小分子在ALS動(dòng)物模型中都展示了出色的效果，但是當(dāng)用到ALS患者身上時(shí)卻總是毫無效果。日本京都大學(xué)的山中伸彌和井上治久教授認(rèn)為，ALS治療藥物開發(fā)的成功率極低是因?yàn)锳LS動(dòng)物模型并不是適合篩選ALS治療藥物的疾病模型；同ALS患者一樣，ALS動(dòng)物模型中的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元也難以直接進(jìn)行研究。于是，井上治久研究組先將ALS患者的皮膚成纖維細(xì)胞誘導(dǎo)成為iPSC，再將iPSC分化成為運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元。這些iPSC-運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元具有ALS的分子病理表型，包括較短的軸突和細(xì)胞質(zhì)聚集體等，并且在氧化脅迫下可以更快地凋亡——至此，確定了來自ALS患者的iPSC-運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元作為研究ALS的體外細(xì)胞模型的可行性。最后，在篩選了4個(gè)小分子化合物后，發(fā)現(xiàn)腰果酸可以逆轉(zhuǎn)運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的ALS病理表型——至此，確定了來自ALS患者的iPSC-運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元作為ALS治療藥物篩選工具的可行性。誘導(dǎo)iPSC的皮膚成纖維細(xì)胞采樣自帶有TDP-43突變基因的家族性ALS患者。TDP-43是一個(gè)由414個(gè)氨基酸組成的核蛋白，含有的2個(gè)RNA識(shí)別模序可與細(xì)胞核內(nèi)的mRNA結(jié)合。TDP-43參與了RNA代謝的多個(gè)步驟，包括mRNA的轉(zhuǎn)錄、剪切和運(yùn)輸?shù)?。采樣患者的皮膚細(xì)胞來自3名不同的家族性ALS患者，分別帶有Q343R、M337V和G298S等3個(gè)不同的TDP-43突變基因，并誘導(dǎo)出9個(gè)不同的iPSC系，用以避免因突變或克隆間的個(gè)體差異產(chǎn)生的錯(cuò)誤。對(duì)照（iPSC-運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元）來自5個(gè)健康成人個(gè)體皮膚成纖維細(xì)胞誘導(dǎo)出的7個(gè)iPSC系。1、ALS患者及對(duì)照的皮膚成纖維細(xì)胞通過逆轉(zhuǎn)錄病毒或游離載體被成功誘導(dǎo)為iPSC，并表達(dá)了人類胚胎干細(xì)胞的生物標(biāo)志物。接著，ALS患者及對(duì)照的iPSC被成功分化為運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元，并表達(dá)了運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的生物標(biāo)志物；當(dāng)這些運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元與肌肉細(xì)胞共培養(yǎng)時(shí)，可產(chǎn)生正確的自發(fā)動(dòng)作電位和突觸電位。TDP-43基因突變并未影響iPSC向運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的分化。2、和對(duì)照相比較的細(xì)胞和分子表型分析發(fā)現(xiàn)，ALS-iPSC-運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元：具有較短的軸突長度，這和在ALS斑馬魚模型中的發(fā)現(xiàn)一致；具有更低的神經(jīng)纖維mRNA含量，這和在ALS患者尸檢中的發(fā)現(xiàn)一致，而且編碼細(xì)胞骨架中間體纖維的基因的表達(dá)量下降，也都與軸突較短的表型相吻合。3、和對(duì)照相比較發(fā)現(xiàn)，ALS-iPSC-運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元：細(xì)胞質(zhì)中出現(xiàn)大量不溶于非離子表面活性劑的包涵體，包涵體內(nèi)含TDP-43蛋白聚集體，這和在ALS患者尸檢中的發(fā)現(xiàn)一致；TDP-43和RNA剪切因子SNRPB2的蛋白含量都有增加，并且在細(xì)胞核中共定位，這也和在ALS患者尸檢中的發(fā)現(xiàn)一致；在亞砷酸鹽誘導(dǎo)的氧化脅迫下，包涵體中TDP-43的含量增加，細(xì)胞存活率顯著下降?；谏鲜?和3，說明ALS-iPSC-運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元可作為ALS病理的體外細(xì)胞模型。4、TDP-43蛋白可以結(jié)合到自身mRNA末端的順式區(qū)域，通過負(fù)反饋機(jī)制調(diào)控自身的蛋白合成。和對(duì)照相比較發(fā)現(xiàn)，ALS-iPSC-運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元中TDP-43蛋白的mRNA含量上升。基因芯片分析結(jié)果顯示，ALS-iPSC-運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元中有關(guān)RNA結(jié)合、加工、剪切和運(yùn)輸、mRNA加工和剪切、以及核糖體蛋白復(fù)合體和RNA剪切復(fù)合體的基因表達(dá)量的上升最為顯著，說明基因轉(zhuǎn)錄和RNA剪切功能失調(diào)。5、根據(jù)上述基因芯片的檢測(cè)結(jié)果，井上治久研究組測(cè)試了4種調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄的小分子藥物：曲古抑菌素A、spliceostatin A、山竹醇和腰果酸。治療ALS藥物的篩選平臺(tái)是在用亞砷酸鹽誘導(dǎo)氧化脅迫與否的條件下，檢測(cè)ALS-iPSC-運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元和對(duì)照-iPSC-運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元細(xì)胞存活的情況：藥物的安全性表現(xiàn)為，當(dāng)藥物處理運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元時(shí)不會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞死亡；藥物的有效性表現(xiàn)為，藥物可以防止ALS-iPSC-運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元在氧化脅迫下凋亡。篩選結(jié)果顯示，腰果酸安全且有效，spliceostatin A和山竹醇安全但無效，曲古抑菌素A不安全且無效。6，驗(yàn)證試驗(yàn)的結(jié)果顯示，在ALS-iPSC-運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元中腰果酸可以將TDP-43的mRNA表達(dá)量降低147倍，降低包涵體中TDP-43蛋白的含量，并增加軸突的長度；這些結(jié)果說明腰果酸可以有效逆轉(zhuǎn)ALS-iPSC-運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的病理表型，是治療ALS的候選藥物，同時(shí)也說明ALS-iPSC-運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元及相關(guān)平臺(tái)可被用于篩選治療ALS的小分子藥物。該項(xiàng)研究成果于2012年發(fā)表在《科學(xué)》雜志子刊《科學(xué)-轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)》上，是用iPSC篩選ALS治療藥物的開創(chuàng)性研究。至于腰果酸是否可在臨床上用于ALS治療，原創(chuàng)研究中僅僅篩選了4個(gè)候選藥物顯然是沒有什么誠意的，試驗(yàn)結(jié)果顯示腰果酸也不是非常安全；特別是作為組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶抑制劑，腰果酸可能涉及的分子生化途徑非常廣泛，并非是特異的ALS靶向藥。因此，該項(xiàng)研究在ALS治療藥物的篩選方面，更傾向于概念驗(yàn)證的性質(zhì)，而實(shí)際上后來腰果酸也沒有進(jìn)入臨床試驗(yàn)。五對(duì)ALS-iPSC-運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的神經(jīng)電生理檢測(cè)和瑞替加濱的發(fā)現(xiàn)對(duì)ALS致病機(jī)理的研究存在著2種假說。第一種是神經(jīng)興奮毒性假說，認(rèn)為過量的谷氨酸突觸活性導(dǎo)致了鈣離子過載和運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元凋亡。第二種是神經(jīng)超興奮性假說，認(rèn)為神經(jīng)軸突細(xì)胞膜的超興奮性導(dǎo)致了ALS——對(duì)運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的電導(dǎo)性研究發(fā)現(xiàn)，ALS患者的軸突細(xì)胞膜的興奮性增加，但是遠(yuǎn)離突觸區(qū)域，且這種超興奮性的程度與ALS患者的生存期負(fù)相關(guān)；軸突細(xì)胞膜超興奮性的產(chǎn)生可能與持續(xù)性鈉電流的上升或延遲整流鉀電流的下降有關(guān)。在ALS動(dòng)物模型（SOD1G93A基因突變）中也發(fā)現(xiàn)了運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的超興奮性。美國哈佛大學(xué)醫(yī)學(xué)院的伊根和沃爾夫教授支持神經(jīng)超興奮性假說。他們的研究組先將家族性ALS患者的皮膚成纖維細(xì)胞誘導(dǎo)成為iPSC，再將iPSC分化成為運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元。多電極芯片和膜片鉗等神經(jīng)電生理檢測(cè)技術(shù)記錄下了ALS-iPSC-運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的超興奮性，再現(xiàn)了ALS患者的神經(jīng)生理學(xué)臨床表型。這種超興奮性的產(chǎn)生可能與延遲整流鉀電流水平的下降有關(guān)；小分子藥物瑞替加濱是一種電壓門控鉀離子通道的激活劑，試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)它可以抑制這種超興奮性，并在體外延長ALS-iPSC-運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的存活。該項(xiàng)研究的結(jié)果表明，對(duì)iPSC-運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的神經(jīng)電生理檢測(cè)可被用來驗(yàn)證疾病的臨床表型、研究ALS的致病機(jī)理以及發(fā)現(xiàn)ALS的治療藥物。這項(xiàng)研究主要分為2大部分。第一部分主要是對(duì)ALS-iPSC-運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的超興奮性在神經(jīng)電生理、細(xì)胞和分子等水平上的表型鑒定。1、ALS-iPSC-運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元來源自2名無親緣關(guān)系、但都攜帶相同的SOD1A4V基因突變的家族性ALS患者。對(duì)照-iPSC-運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元來源自2個(gè)健康成人。2、在攜帶SOD1A4V基因突變的ALS患者與作為對(duì)照的健康成人之間，除了SOD1基因存在差異外，在兩者的基因組上還存在著非常廣泛的單核苷酸多態(tài)性；而這些遺傳背景上的差異可能對(duì)兩者運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元間表型上的差異造成影響，從而使研究結(jié)論產(chǎn)生偏差。為消除這種可能存在的偏差，研究者基于SOD1A4V/+基因型制備了正常（野生型）SOD1+/+基因的近等基因系iPSC；也就是說，突變體和野生型的近等基因系iPSC之間，除了在SOD1基因上的差異外，其他遺傳背景幾乎完全相同。和一般的健康成人的iPSC-運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元相比較，這個(gè)野生型SOD1基因近等基因系的iPSC-運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元是一個(gè)更為嚴(yán)謹(jǐn)?shù)膶?duì)照。3、為了檢測(cè)ALS-iPSC-運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元以自發(fā)放電為表現(xiàn)的興奮性，研究者使用了2種神經(jīng)電生理檢測(cè)技術(shù)。第一種技術(shù)是細(xì)胞外多電極芯片：在每個(gè)培養(yǎng)孔中都有64個(gè)呈網(wǎng)格狀排列的電極，記錄著培養(yǎng)孔中每個(gè)運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的動(dòng)作電位。多電極芯片檢測(cè)結(jié)果顯示，和對(duì)照（包括野生型SOD1基因的近等基因系）相比較，ALS-iPSC-運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元產(chǎn)生的自發(fā)動(dòng)作電位顯著增加，說明其具有超興奮性。第二種技術(shù)是全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)。在響應(yīng)慢速漸進(jìn)式去極化的過程中，ALS-iPSC-運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元觸發(fā)的動(dòng)作電位數(shù)量顯著高于對(duì)照（包括野生型SOD1基因的近等基因系）-iPSC-運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元，說明其具有超興奮性。4、研究者用綠色熒光蛋白GFP標(biāo)記運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元進(jìn)行多電極芯片檢測(cè)，用紅色熒光蛋白R(shí)FP標(biāo)記運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元進(jìn)行膜片鉗檢測(cè)，以保證實(shí)驗(yàn)用細(xì)胞類型的準(zhǔn)確性。5、用膜片鉗技術(shù)還可以定量檢測(cè)出決定神經(jīng)元興奮性的特異性電流。電壓鉗實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，和對(duì)照（包括野生型SOD1基因的近等基因系）相比較，ALS-iPSC-運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的延遲整流鉀離子通道減少，進(jìn)而降低了延遲整流鉀流，從而使觸發(fā)的動(dòng)作電位增加、導(dǎo)致超興奮性。第二部分主要是發(fā)現(xiàn)瑞替加濱可以作為治療ALS的候選藥物。1、在多種電壓門控鉀離子通道中，Kv7通道最適合補(bǔ)償延遲整流鉀流、抑制運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的超興奮性。小分子藥物瑞替加濱是Kv7通道閾下鉀流的特異性激活劑，也是臨床上批準(zhǔn)使用的抗痙攣藥。全細(xì)胞膜片鉗實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯示，瑞替加濱可以阻止ALS-iPSC-運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的自發(fā)放電。多電極芯片記錄的結(jié)果顯示，瑞替加濱可以在抗癲癇的藥理學(xué)濃度上阻止ALS-iPSC-運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的自發(fā)放電。以上結(jié)果說明，瑞替加濱能夠抑制ALS-iPSC-運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的超興奮性。2、當(dāng)在體外培養(yǎng)時(shí)，ALS-iPSC-運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元在成熟15天后開始凋亡，且死亡率始終高于對(duì)照-iPSC-運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元。用瑞替加濱處理14天后，ALS-iPSC-運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的死亡率下降25%，說明瑞替加濱能夠延長ALS-iPSC-運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的存活時(shí)間，其作用機(jī)理與緩解線粒體脅迫有關(guān)。3、上述試驗(yàn)結(jié)果都是基于攜帶SOD1A4V基因突變的家族性ALS患者來源的iPSC-運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元。為了驗(yàn)證ALS-iPSC-運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的超興奮性和瑞替加濱的療效具有普遍性，研究者又針對(duì)攜帶3種不同SOD1基因突變的4名不相關(guān)患者的4個(gè)iPSC系、攜帶C9orf72基因突變的2名不相關(guān)患者的2個(gè)iPSC系和攜帶2種不同F(xiàn)US基因突變的2名不相關(guān)患者的2個(gè)iPSC系進(jìn)行了研究。多電極芯片記錄結(jié)果顯示，分化自這些iPSC系的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元都具有超興奮性，并且它們的自發(fā)動(dòng)作電位都可以被瑞替加濱所阻遏。以上結(jié)果說明，家族性ALS患者的iPSC-運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元在體外具有的超興奮性以及對(duì)瑞替加濱的敏感性都具有普遍性。該項(xiàng)研究成果于2014年發(fā)表在《細(xì)胞》雜志子刊《細(xì)胞-報(bào)告》上，首次對(duì)ALS-iPSC-運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元進(jìn)行了神經(jīng)電生理表型鑒定。值得注意的是，ALS的遲發(fā)性意味著患者在出生后的數(shù)十年后方才起病，然而ALS-iPSC-運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元在成熟后的數(shù)周后即可再現(xiàn)臨床上的病理表型，這可能與ALS-iPSC-運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元在體外缺乏神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的支持及抑制性回路等體內(nèi)環(huán)境有關(guān)，這也是ALS-iPSC-運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元作為病理模型的一個(gè)固有的缺陷。至于瑞替加濱是否可在臨床上用于ALS治療，我本人并不看好。首先，ALS運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的超興奮性僅僅是導(dǎo)致運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元凋亡的可能因素之一，而它和細(xì)胞凋亡之間的關(guān)系也尚不清楚。其次，導(dǎo)致ALS運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元超興奮性的主要原因是持續(xù)性鈉流，這也是ALS延緩藥物利魯唑所靶向的調(diào)控位點(diǎn)；電壓門控鉀離子通道的貢獻(xiàn)位居其次，因此無法期待僅對(duì)它的調(diào)控就可以非常有效地抑制運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的超興奮性。最終，運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的超興奮性可能只是ALS致病機(jī)理中偏下游的病理表型，而非最上游、最主要的觸發(fā)機(jī)制，因此對(duì)它的調(diào)控也許只能起到有限的、延緩病情發(fā)展的作用。當(dāng)然，瑞替加濱作為抗癲癇藥已經(jīng)在臨床上使用了多年，其應(yīng)用在其他神經(jīng)退行性病變上的安全性是有所保障的。瑞替加濱有關(guān)ALS的二期臨床試驗(yàn)由葛蘭素史克公司和哈佛大學(xué)醫(yī)學(xué)院聯(lián)合開展，已于2015年6月開始，并于2018年2月結(jié)束。該項(xiàng)臨床試驗(yàn)雖然是以ALS患者為試驗(yàn)對(duì)象，但是試驗(yàn)的目的并非是檢測(cè)和評(píng)估瑞替加濱治療ALS的效果，而是研究瑞替加濱對(duì)ALS患者運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元興奮性的作用。該項(xiàng)臨床試驗(yàn)采取的主要檢測(cè)方法是用經(jīng)顱磁刺激技術(shù)檢測(cè)上運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的興奮性，以及用神經(jīng)軸突傳導(dǎo)閾值示蹤技術(shù)檢測(cè)下運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的興奮性；并無ALS病情檢測(cè)的常規(guī)內(nèi)容（例如ALS病情指數(shù)、肌力和肺功能等指標(biāo)），而是僅僅記錄應(yīng)試患者自述的肌肉痙攣情況。相關(guān)臨床試驗(yàn)結(jié)果尚未發(fā)表。六用ALS-iPSC-運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元進(jìn)行高通量小分子藥物篩選和博舒替尼的發(fā)現(xiàn)時(shí)隔5年后，日本京都大學(xué)的井上治久研究組再度出擊，以攜帶SOD1基因突變的家族性ALS患者為出發(fā)點(diǎn)，誘導(dǎo)出iPSC系并進(jìn)一步分化出運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元，并以ALS-iPSC-運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的存活率為衡量標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)現(xiàn)有的臨床藥物進(jìn)行了高通量的篩選。在篩選的1416種藥物中，有27種可以在體外提高ALS-iPSC-運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的存活率，其中又有過半的藥物靶向Src/c-Abl信號(hào)途徑。敲低Src/c-Abl的表達(dá)，和使用Src/c-Abl抑制劑一樣，可以延緩ALS運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的凋亡。其中，Src/c-Abl抑制劑博舒替尼可以在ALS運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元中增強(qiáng)自體吞噬，減少突變的SOD1蛋白的錯(cuò)誤折疊，對(duì)來源于多種基因型的家族性和散發(fā)性ALS患者的iPSC-運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元可在體外提高其存活率，并可在體內(nèi)延長ALS小鼠的存活期，因此是治療ALS的候選藥物。Src和c-Abl是在人體內(nèi)廣泛存在的、非受體性的酪氨酸激酶，其編碼基因與病毒編碼的致癌基因同源。Src的激活與細(xì)胞增殖、凋亡、侵染和血管生成相關(guān)，并參與腫瘤形成，因此成為了腫瘤治療的靶標(biāo)。c-Abl的融合蛋白具有致癌性，可導(dǎo)致慢性髓性白血病和急性淋巴細(xì)胞白血病，因此c-Abl的抑制劑已被開發(fā)成為治療慢性髓性白血病的藥物。Src/c-Abl還參與了多種神經(jīng)退行性病變的致病過程，該項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)它們也參與了ALS的致病過程。這項(xiàng)研究主要分為2大部分。第一部分主要是用ALS-iPSC-運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元建立ALS治療藥物的高通量篩選平臺(tái)，并用該平臺(tái)發(fā)現(xiàn)了博舒替尼。1、作為對(duì)照的健康成人和攜帶SOD1L144FVX基因突變的家族性ALS患者的皮膚成纖維細(xì)胞或外周血單核細(xì)胞被誘導(dǎo)成iPSC系；ALS-iPSC系經(jīng)CRISPR-Cas9基因編輯后，被校正為含有（正常的）野生型SOD1基因的近等基因系iPSC，并和來自健康成人的iPSC系一起作為對(duì)照。2、上述iPSC系被分化成運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元，并成功表達(dá)了運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的生物標(biāo)志物；這些iPSC-運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元可與人類成肌細(xì)胞形成神經(jīng)肌肉接點(diǎn)，并具有神經(jīng)電生理活性。ALS-iPSC-運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元中含有突變的SOD1蛋白經(jīng)錯(cuò)誤折疊后形成的聚集體；和對(duì)照相比較，ALS-iPSC-運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元具有較低的細(xì)胞存活率，而其存活率的變化后面被用作篩選ALS治療藥物的主要指標(biāo)。3、高通量藥物篩選的方案：將單細(xì)胞的iPSC放置在96孔板的培養(yǎng)孔中誘導(dǎo)分化，7天后可發(fā)育成運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元；此時(shí)在每個(gè)培養(yǎng)孔中相應(yīng)加入候選的小分子藥物后繼續(xù)培養(yǎng)，在第二個(gè)7天后進(jìn)行固定和微管蛋白免疫染色；之后利用IN 6000型細(xì)胞分析儀對(duì)存活的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元進(jìn)行自動(dòng)化、高通量的圖像捕捉和統(tǒng)計(jì)分析。已知可提高ALS-iPSC-運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元存活率的肯帕羅酮被用作候選小分子藥物的正對(duì)照，載體溶劑DMSO被用作負(fù)對(duì)照。盡管ALS患者的病情具有高度的異質(zhì)性，ALS的細(xì)胞和分子表型以及致病機(jī)理的假說也多種多樣，但是運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的凋亡是所有ALS病例共同的病理特征。因此，使用ALS-iPSC-運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的存活率作為藥物篩選的評(píng)價(jià)指標(biāo)是最為穩(wěn)妥的思路。4、待篩選的小分子藥物文庫包含有1416種化合物，均為目前臨床上正在使用的、或正在進(jìn)行臨床試驗(yàn)的藥物。經(jīng)篩選，其中有27個(gè)化合物可以顯著提高ALS-iPSC-運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的存活率，而其中的14個(gè)化合物均靶向Src/c-Abl信號(hào)途徑。最終，研究者聚焦在了博舒替尼，并著手進(jìn)行下一步的深入研究，因?yàn)椴┦嫣婺峥梢灾苯右种芐rc/c-Abl，作用濃度低，具有劑量依賴性（效果隨劑量的增加而逐漸提高），且沒有細(xì)胞毒性。第二部分主要是驗(yàn)證博舒替尼的作用，及用其治療ALS的分子機(jī)理。1、通過RNA干擾技術(shù)敲低ALS-iPSC-運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元中Src或c-Abl的表達(dá)后，ALS-iPSC-運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的存活率上升，暗示著博舒替尼對(duì)Src/c-Abl的抑制可以延緩ALS運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的凋亡。2、ALS-iPSC-運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元在體外的細(xì)胞和分子病理表型、以及博舒替尼的相關(guān)作用如下：A、西部印記實(shí)驗(yàn)和酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定結(jié)果顯示，Src/c-Abl的磷酸化水平升高，博舒替尼可降低其磷酸化水平；B、蛋白標(biāo)志物檢測(cè)結(jié)果顯示，細(xì)胞的自體吞噬紊亂，博舒替尼可將其恢復(fù)到近正常水平；博舒替尼對(duì)ALS-iPSC-運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的保護(hù)作用可被自體吞噬抑制劑所阻斷，說明博舒替尼的保護(hù)作用可能與增加自體吞噬過程有關(guān)；C、西部印記實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，突變SOD1蛋白的錯(cuò)誤折疊增加，博舒替尼可降低錯(cuò)誤折疊；D、細(xì)胞內(nèi)ATP含量降低，博舒替尼可提高細(xì)胞內(nèi)ATP含量；與卡爾文循環(huán)和呼吸電子傳遞鏈相關(guān)的基因的表達(dá)量上升，博舒替尼可降低其表達(dá)量，說明它可以恢復(fù)細(xì)胞的能量平衡。以上結(jié)果說明，ALS-iPSC-運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元在體外具有ALS的病理表型，并可被博舒替尼逆轉(zhuǎn)。3、上述試驗(yàn)結(jié)果都是基于攜帶SOD1L144FVX基因突變的家族性ALS患者來源的iPSC-運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元。研究者又測(cè)試了2種不同SOD1基因突變、3種不同TDP-43基因突變、3種不同C9orf72基因突變和3名散發(fā)性ALS患者的iPSC系。測(cè)試結(jié)果顯示，博舒替尼可以延長所有這些iPSC-運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的體外存活時(shí)間，并且減少它們因蛋白錯(cuò)誤折疊而產(chǎn)生的聚集體。以上結(jié)果說明，博舒替尼延長運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元體外存活時(shí)間的作用對(duì)家族性和散發(fā)性ALS患者具有普遍性。4、上述試驗(yàn)結(jié)果都來自博舒替尼對(duì)ALS-iPSC-運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的體外實(shí)驗(yàn)。Src/c-Abl抑制劑的體內(nèi)試驗(yàn)結(jié)果顯示，當(dāng)博舒替尼通過腹腔內(nèi)注射進(jìn)入ALS小鼠體內(nèi)后，輕微延緩了小鼠的ALS發(fā)病時(shí)間約10.8天，并延長了小鼠的存活期約7.8天。博舒替尼在ALS小鼠體內(nèi)降低了Src/c-Abl的活性、減少了脊髓內(nèi)突變的SOD1蛋白的錯(cuò)誤折疊、并增加了運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的存活數(shù)量。以上結(jié)果說明，在體內(nèi)博舒替尼對(duì)Src/c-Abl的抑制延緩了ALS運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的退行性病變。該項(xiàng)研究成果于2017年發(fā)表在《科學(xué)》雜志子刊《科學(xué)-轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)》上，是利用ALS-iPSC-運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元對(duì)ALS治療藥物進(jìn)行高通量篩選的經(jīng)典案例。2019年3月28日，日本放送協(xié)會(huì)（NHK）報(bào)道了日本京都大學(xué)井上治久研究組宣布開始進(jìn)行博舒替尼治療ALS的臨床試驗(yàn)。該臨床試驗(yàn)將在京都大學(xué)附屬醫(yī)院等4家醫(yī)療機(jī)構(gòu)開展，募集最多24名應(yīng)試患者；這些應(yīng)試患者將首先連續(xù)12周服用該藥，以確認(rèn)藥物的安全性。到目前（2019年4月21日）為止，該項(xiàng)臨床試驗(yàn)尚未在美國FDA登記。用治療慢性髓性白血病的臨床藥物博舒替尼治療ALS至少有2個(gè)優(yōu)勢(shì)：首先，既然博舒替尼已經(jīng)在臨床上獲得應(yīng)用，說明其用藥安全性是有保障的；另外，博舒替尼是用提高ALS運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的體外存活率作為指標(biāo)篩選出來的，該指標(biāo)直指ALS最基礎(chǔ)、最核心的病理表型——運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的凋亡；由此可見，博舒替尼治療ALS的作用機(jī)理能夠切中要害，而不像瑞替加濱，首先針對(duì)的是降低運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的超興奮性。至于博舒替尼最終是否可在臨床上用于治療ALS，還要看其臨床試驗(yàn)的療效結(jié)果。在最初篩選出的Src/c-Abl抑制劑中，博舒替尼在體外的效果并非最好，但是它具有劑量依賴性，并且可以直接抑制Src/c-Abl，因此最終被研究者選出。博舒替尼在ALS小鼠模型（SOD1G93A）中的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)也是戰(zhàn)績平平，也因此研究者在論文中認(rèn)為臨床轉(zhuǎn)化博舒替尼時(shí)機(jī)尚不成熟，但這和它對(duì)ALS-iPSC-運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元（SOD1G93A）的體外實(shí)驗(yàn)的結(jié)果一致。博舒替尼能夠緩解線粒體逆境脅迫的病理表型也不具有普遍性：在家族性ALS患者中，該表型只存在于攜帶SOD1和C9orf72基因突變的患者中，而不存在于攜帶TDB-43和FUS基因突變的患者中。然而，博舒替尼對(duì)來源自C9orf72基因突變的家族性ALS患者和散發(fā)性ALS患者的iPSC-運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的體外實(shí)驗(yàn)戰(zhàn)績不俗，說明博舒替尼在治療ALS時(shí)潛在的應(yīng)用范圍可能還比較廣泛。七利用iPSC篩選ALS治療藥物的其他研究以上詳細(xì)介紹了3項(xiàng)有關(guān)利用iPSC篩選ALS治療藥物的研究，第一項(xiàng)是該領(lǐng)域的開創(chuàng)性工作，另外兩項(xiàng)也都篩選出了進(jìn)入臨床試驗(yàn)的藥物。利用iPSC篩選ALS治療藥物還有其他很多項(xiàng)研究，下面按時(shí)間順序簡要介紹一下這些研究的成果。1、2013年，《細(xì)胞-干細(xì)胞》，美國哈佛大學(xué)篩選用的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元來自健康小鼠和ALS小鼠（過表達(dá)人類SOD1G93A突變基因）的胚胎干細(xì)胞系——沒錯(cuò)！這里沒有使用人類ALS患者的iPSC系。通過在細(xì)胞培養(yǎng)中戒斷營養(yǎng)因子的供應(yīng)來誘導(dǎo)運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元凋亡，再加入候選藥物，觀察其能否延長運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的生存。篩選過程在384孔板上以高通量、全自動(dòng)的方式進(jìn)行；以具有抗細(xì)胞凋亡作用的蛋白合成抑制劑放線菌酮為正對(duì)照，共篩選了約5000個(gè)化合物和生物活性物質(zhì)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)神經(jīng)保護(hù)因子、具有抗細(xì)胞凋亡作用的蛋白或DNA合成抑制劑、基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑、鈣蛋白酶抑制劑、大麻素受體激活劑、靶向鈣離子通道的神經(jīng)遞質(zhì)受體配基和包括肯帕羅酮在內(nèi)的激酶抑制劑等可延長運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的生存。肯帕羅酮還能夠減少突變的SOD1蛋白的聚集，但不改變運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元軸突和突觸的形態(tài)和神經(jīng)電生理功能。盡管在篩選過程中使用的是小鼠胚胎干細(xì)胞來源的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元，但是在驗(yàn)證過程中使用了攜帶SOD1和TDP-43基因突變的家族性ALS患者來源的iPSC-運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元，并且發(fā)現(xiàn)肯帕羅酮可以延長后者的生存。2、2013年，《分子和細(xì)胞神經(jīng)科學(xué)》，美國iPierian公司ALS-iPSC-運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元來自8名家族性和16名散發(fā)性ALS患者，并被精細(xì)分化為上-和下-運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元；當(dāng)與星形膠質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)時(shí)，可較快產(chǎn)生神經(jīng)電生理特性。早期研究結(jié)果顯示，在全部散發(fā)性ALS患者和非SOD1基因突變的家族性ALS患者的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元內(nèi)都發(fā)現(xiàn)了TDP-43聚集體，說明該病理表型具普遍性，并出現(xiàn)在其他神經(jīng)退行性病變中。在本項(xiàng)研究中，研究者在3名散發(fā)性ALS患者的ALS-iPSC-運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元中也發(fā)現(xiàn)了TDP-43聚集體：這些聚集體位于細(xì)胞核內(nèi)，被高度磷酸化但未被泛素化；這些病理表型與其中1名患者的尸檢結(jié)果一致。由此，研究者以TDP-43核內(nèi)聚集體為篩選指標(biāo)，觀察候選藥物能否抑制TDP-43聚集體的產(chǎn)生。篩選過程在384孔板上以高通量、全自動(dòng)的方式進(jìn)行，共篩選了1757個(gè)化合物，結(jié)果發(fā)現(xiàn)4大類的38個(gè)化合物可減少TDP-43核內(nèi)聚集體：CDK激酶抑制劑（肯帕羅酮同類）、JNK激酶抑制劑、雷公藤甲素和FDA批準(zhǔn)臨床使用的強(qiáng)心苷（地高辛、毛花苷C和原海蔥苷A）。強(qiáng)心苷是鈉/鉀泵抑制劑，能夠改變鈣離子流、提高細(xì)胞內(nèi)ATP含量，而且具有神經(jīng)保護(hù)作用、能夠抑制SOD1聚集體的產(chǎn)生、以及防止多聚谷氨酸誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡。3、2013年，《科學(xué)-轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)》，美國Cedars-Sinai醫(yī)學(xué)中心六核苷酸GGGGCC重復(fù)在C9orf72基因的非編碼區(qū)（啟動(dòng)子或內(nèi)含子等）的擴(kuò)增導(dǎo)致了45%的家族性ALS和10%的散發(fā)性ALS的發(fā)生，并與阿爾茨海默病和帕金森癥等其他神經(jīng)退行性病變的發(fā)生相關(guān)。然而，該重復(fù)的擴(kuò)增是C9orf72基因的功能缺失性突變還是功能獲得性突變尚無定論。對(duì)來自4名攜帶C9orf72基因突變的家族性ALS患者的ALS-iPSC-運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，該基因的表達(dá)量并未下降，敲低其表達(dá)量后對(duì)細(xì)胞也無毒害作用；然而六核苷酸重復(fù)的轉(zhuǎn)錄卻上升了，并形成可能改變RNA代謝的RNA聚集體，同時(shí)。靶向C9orf72基因的反義RNA可以抑制RNA聚集體的形成，并逆轉(zhuǎn)基因表達(dá)譜的改變，進(jìn)一步證明了六核苷酸GGGGCC重復(fù)的擴(kuò)增是該基因的功能獲得性突變。反義RNA目前主要作為一種負(fù)向遺傳學(xué)手段應(yīng)用于對(duì)基因的功能研究，研究者也未調(diào)查該反義RNA對(duì)ALS運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元病理表型的作用。不同于小分子藥物，反義RNA用于人類疾病治療的技術(shù)尚不成熟。因此對(duì)于ALS而言，該反義RNA對(duì)基礎(chǔ)研究的意義遠(yuǎn)大于臨床治療。4、2013年，《神經(jīng)元》，美國約翰霍普金斯大學(xué)對(duì)來自4名攜帶C9orf72基因突變的家族性ALS患者的ALS-iPSC-運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)：六核苷酸GGGGCC重復(fù)在細(xì)胞核內(nèi)形成RNA聚集體；運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的基因表達(dá)譜發(fā)生改變；能夠與六核苷酸GGGGCC重復(fù)相互作用的RNA結(jié)合蛋白ADARB2數(shù)量減少；ALS-iPSC-運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元對(duì)谷氨酸介導(dǎo)的神經(jīng)興奮毒性的敏感度上升100倍。這些病理表型與ALS患者的尸檢結(jié)果一致。接著，研究者構(gòu)建了250多種與C9orf72基因不同區(qū)段的序列互補(bǔ)的反義RNA，且從中篩選出不減少C9orf72基因的表達(dá)量、但可以與六核苷酸重復(fù)序列相結(jié)合并解除其與RNA結(jié)合蛋白相互作用的反義RNA。這些反義RNA可以在體外逆轉(zhuǎn)ALS-iPSC-運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的上述病理表型，包括可以提高其受到谷氨酸脅迫時(shí)的存活率。該項(xiàng)研究同樣證明了六核苷酸GGGGCC重復(fù)的擴(kuò)增是C9orf72基因的功能獲得性突變，即獲得了RNA毒性。盡管這些反義RNA在體外可以延長ALS運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的生存，但是鑒于反義RNA用于人類疾?。ㄓ绕涫侵袠猩窠?jīng)系統(tǒng)的疾病）治療的技術(shù)尚不成熟，因此對(duì)于ALS而言，這些反義RNA對(duì)基礎(chǔ)研究的意義遠(yuǎn)大于臨床治療。5、2015年，《自然》，美國約翰霍普金斯大學(xué)在果蠅中，僅僅六核苷酸GGGGCC重復(fù)本身就能引發(fā)運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的退行性病變；細(xì)胞核質(zhì)運(yùn)輸?shù)恼{(diào)節(jié)因子RanGAP是其抑制子，可以抑制六核苷酸重復(fù)的神經(jīng)毒性，而增強(qiáng)入核運(yùn)輸也可起到同樣的作用。在攜帶C9orf72基因突變的家族性ALS患者的ALS-iPSC-運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元中，六核苷酸重復(fù)可以與人類的RanGAP同源蛋白相結(jié)合并破壞后者的功能，使核蛋白無法從細(xì)胞質(zhì)向細(xì)胞核內(nèi)運(yùn)輸，而靶向六核苷酸重復(fù)的反義RNA則可以恢復(fù)正常的入核運(yùn)輸。在果蠅中，卟啉化合物TMPyP4可以解除六核苷酸重復(fù)和RanGAP之間的結(jié)合，從而恢復(fù)正常的入核運(yùn)輸；核輸出蛋白1抑制劑KPT-276在抑制出核運(yùn)輸?shù)耐瑫r(shí)，也可補(bǔ)償入核運(yùn)輸?shù)娜毕?。TMPyP4和KPT-276都可以抑制六核苷酸重復(fù)引發(fā)的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元退行性病變。TMPyP4和KPT-276并未在ALS-iPSC-運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元中進(jìn)行測(cè)試，而反義RNA也未在ALS-iPSC-運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元中測(cè)試其對(duì)存活率的影響。這3者在該項(xiàng)研究中的作用，還主要是針對(duì)理論驗(yàn)證，證明六核苷酸GGGGCC重復(fù)通過對(duì)細(xì)胞核質(zhì)運(yùn)輸?shù)囊种苼硪l(fā)運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元退行性病變。6、2015年，《自然-通信》，美國威斯康辛大學(xué)針對(duì)當(dāng)前將人類多能干細(xì)胞分化成運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元時(shí)效率低和純度差等問題，張素春研究組改進(jìn)了方法，通過化學(xué)小分子調(diào)控多條信號(hào)途徑，最終在28天內(nèi)可將人類胚胎干細(xì)胞分化成為大量的、高純度（>90%）的、功能完好的成熟運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元；該方法也適用于人類iPSC。在ALS中受損傷的脊髓運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元位于脊髓前角，并將軸突伸向肌肉細(xì)胞以指揮其運(yùn)動(dòng)，軸突變短是ALS的病理表型。研究者用熒光素酶標(biāo)記軸突，以軸突長度的變化作為表型指標(biāo)就可以高通量、全自動(dòng)地篩選ALS治療藥物。利用新的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元分化方法，先導(dǎo)性驗(yàn)證試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)肯帕羅酮和EphA抑制劑可以促進(jìn)ALS-iPSC-運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元軸突的生長，但是利魯唑則不行。攜帶SOD1D90A基因突變的星形膠質(zhì)細(xì)胞能夠抑制ALS-iPSC-運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元軸突的生長，經(jīng)基因校正后的野生型SOD1近等基因系來源的星形膠質(zhì)細(xì)胞則不會(huì)。試驗(yàn)結(jié)果顯示，肯帕羅酮、EphA抑制劑和利魯唑都不能解除SOD1D90A星形膠質(zhì)細(xì)胞對(duì)ALS-iPSC-運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元軸突生長的抑制。該項(xiàng)研究除了建立用人類iPSC分化出運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的新方法外，還驗(yàn)證了以運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元軸突長度為表型指標(biāo)建立高通量、全自動(dòng)的篩選平臺(tái)用以發(fā)現(xiàn)ALS治療藥物的可行性7、2017年，《自然-通信》，比利時(shí)VIB腦科學(xué)和疾病研究中心ALS通常由患者肢體的遠(yuǎn)端起??；由于控制肢體遠(yuǎn)端肌肉的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元具有更長的軸突，因此有假說認(rèn)為軸突運(yùn)輸缺陷導(dǎo)致了ALS。攜帶FUS基因突變的家族性ALS患者的皮膚成纖維細(xì)胞被誘導(dǎo)成iPSC；ALS-iPSC經(jīng)CRISPR-Cas9基因編輯后被校正為含有野生型FUS基因的近等基因系iPSC，并和來自健康成人的iPSC一起作為對(duì)照。ALS-iPSC-運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元在體外具有典型的FUS蛋白亞細(xì)胞定位錯(cuò)誤、低興奮性和軸突運(yùn)輸缺陷。移動(dòng)性的線粒體或內(nèi)質(zhì)網(wǎng)囊泡經(jīng)染色標(biāo)記后進(jìn)行成像和分析，用以定量測(cè)定其沿軸突運(yùn)輸?shù)臄?shù)量：在ALS-iPSC-運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元中的數(shù)量顯著降低，說明軸突運(yùn)輸存在缺陷。組蛋白去乙酰酶HDAC6具有微管蛋白去乙?；钚?，Tubastatin A和ACY-738可特異性地抑制該活性。在ALS-iPSC-運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元中，2個(gè)HDAC6抑制劑可以減少微管蛋白的乙?；⒒謴?fù)正常的軸突運(yùn)輸。盡管Tubastatin A和ACY-738可以通過抑制HDAC6來逆轉(zhuǎn)ALS運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元軸突運(yùn)輸缺陷的病理表型，但是2個(gè)抑制劑至今并未進(jìn)入臨床試驗(yàn)。8、2018年，日本慶應(yīng)義塾大學(xué)，鹽酸羅匹尼羅2018年12月3日，日本共同社報(bào)道了日本慶應(yīng)義塾大學(xué)岡野榮之研究組宣布開始進(jìn)行鹽酸羅匹尼羅治療ALS的I/IIa期臨床試驗(yàn)，用以評(píng)估其安全性和療效。該研究組利用iPSC技術(shù)篩選了1232種目前臨床上正在使用的藥物，并從中發(fā)現(xiàn)目前用于治療帕金森癥的藥物鹽酸羅匹尼羅能夠在體外改善ALS-iPSC-運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的病理表型，包括神經(jīng)軸突縮短、線粒體功能障礙、蛋白質(zhì)異常聚集、氧化應(yīng)激加劇和細(xì)胞凋亡增加等。在該項(xiàng)研究中，iPSC來源自ALS患者的外周血細(xì)胞；在篩選獲得治療ALS的候選藥物中，鹽酸羅匹尼羅可通過血腦屏障并具有較小的副作用，而且不僅對(duì)（除SOD1基因突變外的）家族性ALS患者、對(duì)大約70%的散發(fā)性ALS患者也可能有效。相比較利魯唑和依達(dá)拉奉，預(yù)計(jì)鹽酸羅匹尼羅有其2~3倍的療效，即延長ALS患者的存活期可達(dá)半年。將有20名應(yīng)試ALS患者（20~80歲，發(fā)病不超過5年，ALS病情指數(shù)在24分以上，肺功能在70%以上，住所距離醫(yī)院較近，可疑、可能或確定的輕度ALS患者：基本可以做家務(wù)和工作、或能獨(dú)立進(jìn)行日常生活）參加該項(xiàng)臨床試驗(yàn)，并將服用鹽酸羅匹尼羅片劑半年。繼京都大學(xué)和慶應(yīng)義塾大學(xué)分別針對(duì)骨骼疑難病癥和聽力障礙后，這是日本國內(nèi)第三例利用iPSC技術(shù)篩選出的藥物進(jìn)行的臨床試驗(yàn)，也是全球首例針對(duì)ALS的iPSC發(fā)現(xiàn)新藥的臨床試驗(yàn)。鹽酸羅匹尼羅是英國葛蘭素史克公司根據(jù)多巴胺結(jié)構(gòu)研發(fā)的多巴胺受體激動(dòng)劑，并作為治療帕金森癥的藥物于1996年通過審批。不僅是II型多巴胺受體激動(dòng)劑，鹽酸羅匹尼羅還在動(dòng)物模型中顯示出抗氧化作用、促進(jìn)產(chǎn)生神經(jīng)營養(yǎng)因子及促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞繁殖等神經(jīng)保護(hù)作用，因此可望延緩ALS患者病情的發(fā)展，但不會(huì)使ALS停止發(fā)展、病情逆轉(zhuǎn)或被治愈。早先的研究結(jié)果顯示，可轉(zhuǎn)化為多巴胺的多巴絲肼對(duì)ALS無效。岡野榮之研究組并未發(fā)表其ALS-iPSC-運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的篩選平臺(tái)，也未發(fā)表鹽酸羅匹尼羅治療ALS的驗(yàn)證試驗(yàn)。以上信息主要來自新聞報(bào)道。該項(xiàng)臨床試驗(yàn)也未在美國FDA登記。因此，本文未能就此項(xiàng)研究做詳細(xì)介紹。八利用iPSC篩選治療ALS藥物的總結(jié)早期的ALS治療藥物的篩選和臨床前試驗(yàn)，都是以過表達(dá)人類SOD1突變基因的小鼠或大鼠為病理模型展開的。盡管攜帶SOD1基因突變的家族性ALS患者僅占ALS患者總數(shù)的1~2%，也就是說其發(fā)病率只有千萬分之1~2，但是由于該致病突變發(fā)現(xiàn)較早，又有動(dòng)物模型，因此在相當(dāng)長的時(shí)間里被廣泛應(yīng)用在ALS的基礎(chǔ)研究和藥物篩選中。和ALS動(dòng)物模型相比較，ALS-iPSC-運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元具有以下優(yōu)勢(shì)：A、人類細(xì)胞；B、來自真實(shí)的ALS患者，包括那些在遺傳學(xué)上尚未發(fā)現(xiàn)致病基因的散發(fā)性ALS患者；C、可以將ALS的病灶——運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元從復(fù)雜的生理結(jié)構(gòu)中剝離出來，單獨(dú)進(jìn)行研究；D、在細(xì)胞和分子水平上可重現(xiàn)生理和解剖水平上的病理表型，并以此進(jìn)行表型篩選；E、體積小、純度高、同步性好、重復(fù)性好、可以大量擴(kuò)增，適合高通量的藥物篩選。不難想象，以ALS-iPSC-運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元為篩選平臺(tái)及驗(yàn)證模型，將成為今后ALS治療藥物發(fā)現(xiàn)和臨床前試驗(yàn)的“標(biāo)配”，也將在ALS的基礎(chǔ)研究和生物標(biāo)志物發(fā)現(xiàn)中發(fā)揮重要作用。最后總結(jié)一下，利用iPSC篩選治療ALS藥物的重點(diǎn)在以下4方面：1、ALS-iPSC-運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的來源家族性ALS患者的來源具有以下3個(gè)優(yōu)勢(shì)：A、致病的基因突變明確；B、細(xì)胞和分子表型清晰；C、相關(guān)的研究結(jié)果豐富。因此，目前仍是用于ALS治療藥物篩選的首選。家族性ALS患者的來源在具體使用上具有以下2方面的趨勢(shì)：A、同時(shí)使用多種家族性ALS的遺傳背景，包括SOD1、C9orf72、TDP-43和FUS等基因突變，同時(shí)使用同一基因突變的多個(gè)患者來源，以及同時(shí)使用一個(gè)患者來源的多個(gè)iPSC系；B、通過CRISPR-Cas9基因編輯技術(shù)，將ALS-iPSC中的突變型基因校正為野生型基因，制備近等基因系iPSC，并和來自健康成人的iPSC一起作為對(duì)照。散發(fā)性ALS占90~95%的患病比例，也是用iPSC技術(shù)篩選ALS治療藥物最大的優(yōu)勢(shì)之一。至少在藥效驗(yàn)證階段，應(yīng)該使用多個(gè)散發(fā)性ALS患者的來源，以確保候選藥物的廣譜性。2、ALS-iPSC-運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元用于藥物篩選的病理表型A、運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元死亡是最具有普遍性和代表性的病理表型，其鑒定方法也相對(duì)簡單。當(dāng)然，運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元死亡也分為發(fā)育中的自然凋亡、去掉營養(yǎng)因子后誘發(fā)的死亡、以及添加脅迫因子后誘發(fā)的死亡等不同的方式?？紤]到ALS實(shí)際發(fā)病具有遲發(fā)性（患者在出生后的數(shù)十年后方才起?。?，以及運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元實(shí)際上在體內(nèi)處于被神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞支持等更加復(fù)雜的生理環(huán)境中，因此運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元在體外短期內(nèi)的死亡過程也未必能如實(shí)還原在體內(nèi)對(duì)應(yīng)的病理表型，而找到更接近運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元在體內(nèi)衰老過程的體外誘導(dǎo)方法也是目前該領(lǐng)域亟待解決的一個(gè)問題。B、比較具有普遍性的病理表型還包括TDP-43聚集體的產(chǎn)生和運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元興奮性的變化等。而細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)異常、細(xì)胞核質(zhì)運(yùn)輸缺陷、線粒體功能異常、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)脅迫、RNA代謝異常和聚集體的產(chǎn)生、軸突長度變短和軸突運(yùn)輸缺陷等病理表型可能只與個(gè)別ALS遺傳背景相關(guān)，因此上述研究中但凡使用了這些病理表型進(jìn)行的藥物篩選，選出的小分子化合物可能對(duì)ALS患者并不具有普遍的適用性。C、ALS-iPSC-運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元用于藥物篩選的病理表型，無疑是決定篩選成功與否的最重要的因素。其間，各種病理表型在篩選成本上也存在較大的差異；使用多種表型指標(biāo)可以提高篩選的準(zhǔn)確性，但也會(huì)顯著地增加篩選的成本。在篩選階段使用細(xì)胞存活率外加一個(gè)普遍性、特異性的病理表型指標(biāo)，在驗(yàn)證階段則綜合使用多個(gè)病理表型進(jìn)行篩查，可以在控制成本的前提下提高ALS治療藥物篩選的成功率。3、ALS-iPSC-運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元用于藥物篩選的試驗(yàn)平臺(tái)A、常用的96孔板或384孔板系統(tǒng)，不僅可用于運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的培養(yǎng)，而且可與一般的小分子化合物文庫對(duì)接，還適合高通量、全自動(dòng)的移液和圖像采集。B、利用共聚焦顯微鏡進(jìn)行熒光成像是最通用、也是最簡單的成像方式，因此對(duì)ALS-iPSC-運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元病理表型的指標(biāo)鑒定和定量測(cè)量應(yīng)盡量使用這個(gè)技術(shù)。圖像信號(hào)通常來自自發(fā)熒光（例如GFP或RFP）、熒光染色（例如熒光免疫雜交）或熒光顯色（例如熒光素酶反應(yīng)）。相反，對(duì)運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元進(jìn)行高通量的神經(jīng)電生理測(cè)定就需要相對(duì)復(fù)雜的儀器設(shè)備（例如多電極芯片），盡管神經(jīng)電生理測(cè)定是對(duì)成熟運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的功能最準(zhǔn)確、最標(biāo)準(zhǔn)的檢測(cè)和評(píng)估方法。C、iPSC除了具有人類真實(shí)的ALS遺傳背景外，另一個(gè)不容遺棄的優(yōu)勢(shì)就是多能性。iPSC不僅可以分化成運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元，還可以分化成具有相同基因型的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞；將兩者共培養(yǎng)，可以在體外為運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元提供一個(gè)更接近體內(nèi)真實(shí)生理環(huán)境的發(fā)育條件，而在該條件下對(duì)運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元進(jìn)行的藥物篩選也將獲得更加準(zhǔn)確的結(jié)果。4、藥物篩選使用的小分子化合物文庫由于本文綜述的幾項(xiàng)研究或者主要著眼于基礎(chǔ)理論的發(fā)現(xiàn)，或者對(duì)ALS治療藥物的篩選平臺(tái)進(jìn)行概念驗(yàn)證，因此這幾項(xiàng)研究或者僅用了少數(shù)幾個(gè)特異性的抑制劑，或者僅篩選了體量較小的化合物文庫。如果篩選的化合物文庫是目前臨床上正在使用的藥物，那么從中發(fā)現(xiàn)的候選的ALS治療藥物的作用機(jī)理已經(jīng)比較明確，也利于在細(xì)胞和分子表型上進(jìn)行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證；同時(shí)，其用藥安全性也是有保障的，加之可以走孤兒藥登記的綠色通道，一旦有效其市場化的進(jìn)程將會(huì)是非?？旖莸摹?duì)于篩選超大體量的小分子化合物文庫，則應(yīng)等待ALS致病機(jī)理取得突破性進(jìn)展后再行展開——對(duì)引發(fā)疾病的最上游、最主要的代謝或信號(hào)途徑進(jìn)行大規(guī)模的抑制劑篩選才最有效。鑒于ALS是非常罕見的疾病，其治療藥物的市場容量很小，屆時(shí)希望能有富有社會(huì)責(zé)任感、富有人文關(guān)懷精神的大型制藥企業(yè)站出來承擔(dān)這項(xiàng)成本高昂的篩選工作。結(jié)束語2016年，全球ALS藥物的市場體量約為5300萬美元；預(yù)計(jì)到2021年，全球ALS藥物及療法的市值將增至4.68~8.40億美元之間，并將節(jié)省出更多的健康護(hù)理費(fèi)用——僅在美國，2017年的ALS的患者看護(hù)費(fèi)用就高達(dá)60億美元?？梢姡碌腁LS治療藥物市場前景廣闊，又有孤兒藥資格的綠色通道助力，更是ALS患者期待已久的福音。早先ALS治療藥物的篩選是建立在ALS動(dòng)物模型的試驗(yàn)基礎(chǔ)上，而當(dāng)用于ALS患者身上時(shí)，或是因?yàn)橐庀氩坏降亩靖弊饔?，或是因?yàn)榀熜Р患?，致使在過去10年里進(jìn)行的80多項(xiàng)臨床試驗(yàn)幾乎全軍覆沒。利用iPSC篩選治療ALS藥物是革命性的技術(shù)，必將改寫該領(lǐng)域的格局，并加速更安全、更高效的ALS治療藥物的發(fā)現(xiàn)。ALS-iPSC-運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元還可以幫助研究者更快地解密ALS的核心致病機(jī)理，而只有靶向ALS致病的最上游、最主要的代謝或信號(hào)途徑開發(fā)治療藥物，才是最根本、最有效的。可是誰又知道呢？不管黑貓白貓，能抓到耗子就是好貓。不過對(duì)于已經(jīng)患病的ALS患者，想要減緩病情的發(fā)展或者停止病情的發(fā)展，可以靠小分子藥物；但是想要逆轉(zhuǎn)病情的發(fā)展或者根本上治愈，最終還要依靠干細(xì)胞治療技術(shù)——而后者，也將是iPSC可以大顯身手的戰(zhàn)場。再次感謝Christian給我們帶來的干細(xì)胞治療ALS的信息，希望常在。2019年05月03日10603
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董漪副主任醫(yī)師 復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院 神經(jīng)內(nèi)科 肌萎縮側(cè)索硬化癥是一種罕見的神經(jīng)退行性疾病。近2年來，依達(dá)拉奉（MCI 186）逐漸被ALS醫(yī)師及研究者關(guān)注，成為了第二個(gè)獲得美國FDA批準(zhǔn)的可用于治療漸凍人的藥物。 該研究發(fā)表于2017年《ALS&FTD》雜志，整體研究是陰性結(jié)果。也就是使用依達(dá)拉奉治療并不能改善ALS患者的臨床結(jié)局。臨床結(jié)局評(píng)價(jià)是按照ALSFRS—R評(píng)估的，這是一個(gè)在ALS門診常用的臨床評(píng)估工具。 雖然整體人群是陰性的，但通過分析得出了一個(gè)有希望有效亞組人群，稱為dpEESP2y人群。 EESP人群是指基本不存在呼吸困難（FVC%>80%）且每個(gè)ALSFRS-R項(xiàng)目總分大于2分，也就是說病情比較重輕的患者。而dpEESP2y則需要基于上面的臨床基礎(chǔ)外，需要臨床達(dá)到確診或者擬診，且病程＜2年。 該亞組研究提示僅dpEESP2y的患者中使用依達(dá)拉奉可能與臨床癥狀惡化減緩相關(guān)。 因此，臨床醫(yī)師應(yīng)該慎重推薦在合適的ALS患者使用依達(dá)拉奉方案。2019年04月03日7546
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姚曉黎主任醫(yī)師 中山一院 神經(jīng)科 ALS患者常伴有營養(yǎng)不良，其原因可能包括吞咽困難、肢體無力及患者心理因素導(dǎo)致食欲下降、進(jìn)食減少，使得能量攝入不足；疾病導(dǎo)致機(jī)體代謝率增高、能耗增高。營養(yǎng)不良會(huì)使患者病情進(jìn)展加快，因此，加強(qiáng)營養(yǎng)支持在ALS患者治療中尤為重要。當(dāng)患者延髓肌肉受累時(shí)，會(huì)引起吞咽困難、飲水嗆咳，不少患者會(huì)有流涎、流鼻涕等情況。當(dāng)ALS患者出現(xiàn)咀嚼和吞咽問題時(shí)，應(yīng)改變食譜，建議患者少食多餐、進(jìn)食軟食（比如爛飯、米糊等）、非流食（如避免湯等，因進(jìn)食液體易引起嗆咳），必要時(shí)可使用增稠劑將液體調(diào)成糊狀以增加水分?jǐn)z入量，并避免食用刺激性食物。選擇合適的體位進(jìn)食，進(jìn)食應(yīng)小口、緩慢，避免食物誤吸入肺內(nèi)引起窒息或肺炎，進(jìn)食后保持坐位半小時(shí)以避免食物返流、嗆咳。有條件的患者可接受吞咽訓(xùn)練等適當(dāng)?shù)目祻?fù)治療，可一定程度上緩解吞咽困難、流涎等癥狀，具體可咨詢康復(fù)科醫(yī)師。受流涎癥狀困擾的患者，注意調(diào)整頭的位置（低頭時(shí)流涎加重，吞咽困難時(shí)仰頭易引起嗆咳），并有意識(shí)地鍛煉用一定力量閉口，對(duì)控制流涎有一定幫助，必要時(shí)可在神經(jīng)科醫(yī)師指導(dǎo)下服用少量阿米替林減少唾液分泌，改善癥狀。流鼻涕的患者可用熱水蒸汽熏蒸鼻子，以減輕癥狀。當(dāng)以上均不能這些措施仍不能保證患者攝取足夠的營養(yǎng)，患者出現(xiàn)進(jìn)行性吞咽困難、體重加速下降、脫水、嗆咳導(dǎo)致進(jìn)餐過早停止時(shí)，應(yīng)盡早使用營養(yǎng)供給裝置為患者人工補(bǔ)充足夠營養(yǎng)。經(jīng)鼻腔置入鼻飼管一般為患者提供2-3周的營養(yǎng)支持，并且對(duì)患者造成鼻咽部刺激感，患者感覺不舒服，也容易引起反流、誤吸。對(duì)于需長期人工補(bǔ)充營養(yǎng)的ALS患者，我們建議采用更方便、更安全的胃造瘺管。經(jīng)皮內(nèi)鏡胃造瘺術(shù)（PEG），指在胃鏡引導(dǎo)下，在患者上腹部經(jīng)皮穿刺留置胃飼管，可經(jīng)造瘺管注入食物及水分，從而能補(bǔ)充營養(yǎng)，保證足夠的能量和液體攝入，對(duì)于延長ALS患者生存期和改善生活質(zhì)量有作用。此外，PEG本身的操作相對(duì)簡單，風(fēng)險(xiǎn)和創(chuàng)傷不大，有經(jīng)驗(yàn)的醫(yī)師可將風(fēng)險(xiǎn)控制在極低的幾率內(nèi)。經(jīng)皮內(nèi)鏡胃造瘺術(shù)由專業(yè)的消化科內(nèi)鏡醫(yī)師進(jìn)行操作，由于ALS患者吞咽困難通常伴隨著呼吸功能下降，當(dāng)呼吸功能下降時(shí)，行PEG操作風(fēng)險(xiǎn)將加大，因此我們建議患者如果出現(xiàn)進(jìn)行性吞咽困難，應(yīng)盡早行手術(shù)。許多患者及家屬對(duì)手術(shù)操作存有恐懼，誤以為PEG會(huì)對(duì)以后的生活帶來很大不便，其實(shí)PEG術(shù)后患者不僅可保留現(xiàn)有的吞咽和說話能力，可依舊經(jīng)口進(jìn)食，也不妨礙運(yùn)動(dòng)和洗澡，出門時(shí)穿上衣服也不會(huì)因?yàn)楦共吭殳浛谟绊懲庥^。而且由于營養(yǎng)狀態(tài)的保證，對(duì)于以上日常生活能力的保持有很大幫助。關(guān)于術(shù)后胃造瘺口的護(hù)理，家屬需要注意的是每次經(jīng)造瘺管喂食后注入清水，避免造瘺管堵塞；保持造瘺口清潔干燥，避免造瘺口感染；觀察造瘺管有無移位等。一般護(hù)理得當(dāng)?shù)那闆r下造瘺口感染情況并不多見，如果出現(xiàn)造瘺口發(fā)紅、腫脹、疼痛、液體滲出等感染癥狀，盡快到醫(yī)院就診，予抗感染、局部換藥等處理。2014年10月27日8191
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魯明主任醫(yī)師 北京朝陽醫(yī)院 神經(jīng)內(nèi)科 如前一篇文章所述，窄義的“運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元病”（MND）指“肌萎縮側(cè)索硬化”（ALS），因此這里所說的治療指的是ALS的治療。西醫(yī)對(duì)任何疾病治療的基本思路是明確病因和發(fā)病機(jī)制，針對(duì)其病因和發(fā)病機(jī)制進(jìn)行治療。例如細(xì)菌性肺炎的病因是細(xì)菌感染，因此其基本的治療原則就是抗生素殺滅細(xì)菌。而ALS的發(fā)病機(jī)制并不明確，這也就是目前西醫(yī)無確切的有針對(duì)性的治療的根本原因。雖然發(fā)病機(jī)制不清，但通常認(rèn)為其共同的病理過程包括“氧化損傷”、“興奮性氨基酸毒性作用”、“線粒體功能障礙”等。目前的治療也是針對(duì)這幾方面進(jìn)行。利魯唑（力如太）是一種興奮性氨基酸拮抗劑，針對(duì)的是“興奮性氨基酸毒性作用”這一機(jī)制，這也是迄今為止唯一經(jīng)過臨床驗(yàn)證可以延緩ALS進(jìn)展的藥物。1994年，Bensimon G在著名的“新英格蘭醫(yī)學(xué)雜志”發(fā)表了第一篇有關(guān)利魯唑治療ALS的小規(guī)模隨機(jī)雙盲對(duì)照研究。結(jié)果顯示，利魯唑組患者肌無力發(fā)展速度明顯變慢，用藥1年后的生存比例更高，其中球部起病的患者獲益更大。1996年，兩項(xiàng)大規(guī)模臨床試驗(yàn)的結(jié)果在“Neurology”上公布，結(jié)果均顯示，利魯唑可適當(dāng)延長患者生存期。同年，“Lancet”上的另一篇研究比較了不同劑量利魯唑的效果，結(jié)果顯示，100mg/d的劑量最有效，同時(shí)患者耐受性最好。50mg/d的劑量也有效，但不如100mg/d好，而200mg/d的副作用太大，患者難以耐受。近20年來，不斷有基礎(chǔ)和臨床研究驗(yàn)證，利魯唑可適當(dāng)延緩患者生存期。但它的效果只限于使病情發(fā)展減慢，而不能使病情逆轉(zhuǎn)，也很難使病情停止發(fā)展，也不能使患者力量恢復(fù)。這一點(diǎn)，在服藥之前一定要非常清楚。由于此藥較貴，我們建議，如果患者經(jīng)濟(jì)條件允許，可使用100mg/d的劑量（50mg/次，2次/天），在服藥前后1小時(shí)不宜服用其他藥物或食物。如經(jīng)濟(jì)條件不好，可使用50mg/d的劑量（25mg/次，2次/天）。各項(xiàng)研究均顯示，本藥越早使用，效果越好，對(duì)于已發(fā)展至晚期的患者，不再建議使用。因此，早期診斷、早期治療非常關(guān)鍵。利魯唑可能會(huì)導(dǎo)致少數(shù)患者的肝功異常，因此在服藥后1個(gè)月要檢測(cè)肝功，以后也要定期復(fù)查。如果肝功超過正常上限3倍，不建議繼續(xù)使用。此外，少數(shù)患者服藥后肌無力反而明顯加重，這部分患者也不宜繼續(xù)使用。對(duì)于因各種原因無法服用利魯唑的患者，可以使用大劑量“維生素C+維生素E+輔酶Q10+左卡尼汀”。大劑量維生素C和維生素E是強(qiáng)抗氧化劑，針對(duì)的是“氧化損傷”機(jī)制，而“輔酶Q10+左卡尼汀”是線粒體功能保護(hù)劑，針對(duì)的是后一種機(jī)制。這一復(fù)方組合理論上是有效的，但未經(jīng)過臨床驗(yàn)證，優(yōu)點(diǎn)是價(jià)格便宜，副作用小，患者耐受性良好。除了藥物，ALS患者還有兩點(diǎn)需要特別注意，那就是保障營養(yǎng)供應(yīng)和氧供，這兩點(diǎn)的作用甚至比藥物更為重要。ALS是高消耗疾病，一旦出現(xiàn)營養(yǎng)不足或氧供減少，病情會(huì)迅速進(jìn)展。因此，患者平時(shí)的飲食以高熱量高蛋白為主，不要食用味精雞精及各種鮮味劑，不要服用“降脂藥”。要保證體重不降低甚至略有增加。如果患者體重較發(fā)病前降低超過10%，或吃飯時(shí)間超過30分鐘，要考慮進(jìn)行“胃造瘺”手術(shù)，胃造瘺即是通過胃鏡在腹壁上留置管道，通過造瘺口進(jìn)食。雖然聽起來較恐怖，但實(shí)際操作和護(hù)理并不復(fù)雜，患者平時(shí)也不會(huì)有明顯不適，只是洗澡受些影響。留置的造瘺管每年更換一次即可?；颊卟∏榘l(fā)展到一定程度，會(huì)出現(xiàn)憋氣、氣短等癥狀，此時(shí)，要進(jìn)行“肺功能”檢查，如FVC值小于75%，要考慮使用“無創(chuàng)呼吸機(jī)”。有的患者詢問吸氧能否解決問題，答案是否定的。ALS患者主要是由于呼吸肌的無力，導(dǎo)致氣體不能吸入及呼出肺部，此時(shí)吸氧并不能使氧氣進(jìn)入肺部。而無創(chuàng)呼吸機(jī)可以幫助患者增加吸氣和呼氣的幅度、深度，從而來完成氣體交換。由于患者呼吸均有問題，因此一定要選擇雙水平無創(chuàng)呼吸機(jī)。開始可每天使用1小時(shí)，待患者耐受后逐漸增加使用時(shí)間和頻率。利魯唑、保證營養(yǎng)供應(yīng)（胃造瘺）、保證氧供（無創(chuàng)呼吸機(jī)）是已被證實(shí)可延緩病情發(fā)展的三大治療方法。此外，還有一些專門改善癥狀的對(duì)癥治療。如對(duì)合并焦慮的患者可使用“5羥色胺再攝取抑制劑”、失眠的患者可使用新型抗失眠藥如“左匹克隆”或“思諾思”，不建議使用安定類藥物，因?yàn)楹笳呖杉又丶o力、抑制呼吸。口水增多可使用“阿米替林”或“654-2”以減少唾液分泌，前者同時(shí)有抗焦慮抑郁作用，但這類藥副作用較大，建議在醫(yī)生指導(dǎo)下使用。疼痛患者可使用“芬必得”等非甾體抗炎藥。痰多不易咳出患者可使用化痰藥、咳痰機(jī)輔助咳痰等。針對(duì)ALS可能的各種機(jī)制，曾經(jīng)進(jìn)行過各種藥物臨床試驗(yàn)，較為著名的有“鋰劑”、“頭孢曲松”、“集落細(xì)胞刺激因子”、“特殊類型的免疫調(diào)節(jié)劑”等，但均已失敗告終。今年的ALS年會(huì)報(bào)道一種叫做NP001的寡核苷酸調(diào)節(jié)劑可能對(duì)ALS有效，但還未經(jīng)過大規(guī)模臨床驗(yàn)證。由于迄今為止，ALS的發(fā)病機(jī)制仍不清楚，因此治療方面還有很長的路要走。特別需要指出的是，一些所謂的宣稱可以治療甚至治愈ALS的方法，均未得到臨床證實(shí)，最為著名的就是“干細(xì)胞移植”。衛(wèi)生部早在2008年即專門發(fā)表聲明，指出我國未批準(zhǔn)干細(xì)胞移植應(yīng)用于血液病治療之外的任何領(lǐng)域?！案杉?xì)胞治療”確實(shí)擁有廣闊前景，但在細(xì)胞移植通路、細(xì)胞存活和生長分化途徑等諸多方面的問題均未解決，不是簡單通過輸液或腰穿或立體定向移植就能獲得成功的。對(duì)于少數(shù)國家批準(zhǔn)的，獲得國家資助的干細(xì)胞移植研究，均是免費(fèi)的，并會(huì)向家屬充分告知可能面臨的風(fēng)險(xiǎn)。目前，少數(shù)醫(yī)院或醫(yī)生卻大肆宣傳干細(xì)胞移植效果，吸引患者花巨資進(jìn)行所謂的干細(xì)胞移植，不但看不到任何效果，還承受了巨額經(jīng)濟(jì)損失，最重要的是失去了寶貴的治療時(shí)機(jī)。由于我國特殊的體制，衛(wèi)生部門對(duì)這些醫(yī)院不能進(jìn)行監(jiān)管。與此相類似的還有許多自創(chuàng)的所謂各種療法，例如“神經(jīng)再生”、“神經(jīng)修復(fù)”等等，無不以招攬病人、騙取錢財(cái)為第一要?jiǎng)?wù)，提醒廣大患者及患者家屬不要上當(dāng)。對(duì)于中醫(yī)，其對(duì)疾病的認(rèn)識(shí)和治療理念與西醫(yī)完全不同，西醫(yī)是辨病論治，而中醫(yī)是辯證論治。ALS在中醫(yī)屬于“痿證”，也屬于較難醫(yī)治的癥候，如果辯證準(zhǔn)確，我們不否認(rèn)中醫(yī)對(duì)ALS可能具有一定治療效果，也不反對(duì)患者中西醫(yī)結(jié)合治療。但由于中醫(yī)的玄妙，容易被人利用，因此提醒患者一定要到正規(guī)的公立三甲醫(yī)院就診。識(shí)別偽中醫(yī)的方法是：如果不給方子、不允許患者自行到藥店買藥而只能在醫(yī)院拿藥，那一定是騙人的。在生活護(hù)理方面，ALS患者要注意適當(dāng)活動(dòng)，以不勞累為準(zhǔn)，不要進(jìn)行大運(yùn)動(dòng)量的鍛煉，避免外傷，保持心情愉快，樂觀的態(tài)度對(duì)延緩疾病發(fā)展很有幫助。2014年07月03日14369
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李曉光主任醫(yī)師 北京協(xié)和醫(yī)院 神經(jīng)科 肌萎縮側(cè)索硬化（運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元疾?。┗颊呒凹覍俪３Ｐ枰诨颊叩呐R床治療方面做出非常困難的決策，最終都要做出以下兩種最常見的決策：即當(dāng)患者咀嚼和吞咽困難時(shí)是否使用喂食管以及自主呼吸困難時(shí)是否使用呼吸機(jī)。如果患者病了數(shù)年，家人可能會(huì)忽視了考慮患者將來可能發(fā)生的并發(fā)癥。有時(shí)病情進(jìn)展比較緩慢，也很容易忽視病情即將惡化的先兆癥狀。在這些問題發(fā)生之前盡可能多了解疾病知識(shí)并討論，將有助于避免在危險(xiǎn)情況發(fā)生時(shí)被動(dòng)地做出倉促?zèng)Q定。2008年01月13日116
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